i

CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -CONCYT-

SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -SENACYT-

FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -FONACYT-

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACIA

UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA-USAC-

INFORME FINAL

EVALUACIÓN DE DAÑO PRIMARIO AL ADN, POR ENSAYO COMETA EN

CÉLULAS SANGUÍNEAS DE RATAS EXPUESTAS A PIRETROIDES CON

DIESEL COMO DISOLVENTE, QUE SE UTILIZAN PARA CONTROL DE

VECTORES EN GUATEMALA.

PROYECTO FODECYT No. 21-2010

AMARILLIS SARAVIA GÓMEZ Ph.D.

Investigador Principal

GUATEMALA, ABRIL DE 2014

ii

AGRADECIMIENTOS:

La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del Fondo

Nacional de Ciencia y Tecnología, -FONACYT-, otorgado por la Secretaría Nacional de

Ciencia y Tecnología -SENACYT- y al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología -

CONCYT-

iii

OTROS AGRADECIMIENTOS:

Adicionalmente se agradece a la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de la

Universidad de San Carlos de Guatemala.

Biografía académica de los autores:

Amarillis Saravia Gómez Ph.D.

Química Farmacéutica, Doctorado en Farmacia con énfasis en Farmacología de la

Universidad de Clermont-Ferrad, Francia, Internado de Farmacia Hospitalaria en Hospital

de Vichy. Francia. Catedrática y Jefa de departamento de Farmacología y Fisiología y

Directora del Bioterio desde 1980 a la fecha, cuenta con más de 60 publicaciones nacionales

e internacionales, es miembro activa en más de 20 instancias académicas y científicas

nacionales e internacionales, asesora y revisora de más de 60 tesis ad gradum, expositora en

diversos foros, congresos y ponencias internacionales. Medalla de investigadora

internacional Toledo España.

Lic. Rodrigo Vargas

Químico Farmacéutico graduado de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de la

Universidad de San Carlos de Guatemala, con estudios de maestría en Biotecnología,

especialización en Nanotecnología en el 2009 y Biología Molecular y Genética en el 2013,

así como capacitaciones en procedimientos experimentales en ratas y ratones, por la

asociación chilena de animales de laboratorio en 2012, cuenta con más de ocho

investigaciones realizadas con fondos concursables, participando como investigador

principal y asociado, recibiendo en 2010 el reconocimiento a la investigación relevante

como investigador principal por la Dirección General de Investigación, USAC. Catedrático

en la Facultad de Ciencias de la Salud de la Universidad Mariano Gálvez, cuenta con dos

publicaciones internacionales y varias nacionales.

Licda. Dulce Saldaña

Química Farmacéutica graduada de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de la

Universidad de San Carlos de Guatemala en 2007, Tiene una especialización en

Toxicología Experimental y Manejo de Animales de Laboratorio en la Universidad de la

Habana, 2009. Investigadora del Centro de Información y Asesoría Toxicológica (CIAT) en

2007, y del Herbario de la Universidad de San Carlos de Guatemala (USCG-CECON) en

2007, Becaria de la Facultad Latinoamericana de Ciencias Sociales (FLACSO) en 2008.

Catedrática Titular en la Facultad de Ciencias Médicas y de la Salud de la Universidad

Mariano Gálvez desde 2010. Ha participado como investigadora principal y asociada en

proyectos de cofinanciamiento. Cuenta con publicaciones nacionales e internacionales, entre

las que destaca “Plantas Tóxicas de Guatemala” publicada por el Instituto Nacional de

Biodiversidad de Costa Rica (INBio) 2010.

El equipo de investigación agradece muy especialmente la participación y apoyo

incondicional del Br. Cristian López, quien funge como técnico de bioterio y auxiliar de

investigación en el Bioterio de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia, USAC.

También agradece al M.Sc. Gerardo Arroyo Del Departamento de Citohistología de la

escuela de Química Biológica. Y al Departamento de Patología de la Facultad de

Veterinaria y Zootecnia, por su apoyo durante la fase experimental del presente trabajo de

investigación.

iv

Equipo de investigadores del proyecto FD 21-2010

De derecha a izquierda:

Licda. Dulce Saldaña, Lic. Rodrigo Vargas, Ph.D. Amarillis Saravia y Br. Cristian López.

Bioterio Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia

v

CONTENIDO

Índice RESUMEN _________________________________________________________ 1

ABSTRACT ________________________________________________________ 2

PARTE I _____________________________________________________________ 3

I.1. INTRODUCCIÓN _______________________________________________ 3

I.2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA _________________________________ 4

I.2.1. Antecedentes en Guatemala_____________________________________ 5

I.2.2. Justificación del trabajo de investigación __________________________ 7

I.3. OBJETIVOS E HIPÓTESIS _________________________________________ 8

I.3.1. Objetivos ____________________________________________________ 8

I.3.1.1.Objetivo General ______________________________________________ 8

I.3.1.2. Objetivos Específicos ___________________________________________ 8

I.3.2. Hipótesis ____________________________________________________ 8

I.4. METODOLOGÍA: ________ _______________________________________9

I.4.1. Localización (coordenadas geográficas) _________________________________ 9

I.4.2.Variables _____________________________________________________ 9

I.4.2.1.Variables dependientes _________________________________________ 9

I.4.2.2.Variables independientes_____________________________________ 9

I.4.3. Indicadores __________________________________________________ 9

I.4.4.Estrategia metodológica _________________________________________ 9

I.4.4.1. Población y muestra ________________________________________ 9

I.4.5.Método ______________________________________________________ 9

I.4.6. Tratamiento estadístico ________________________________________ 11

PARTE II ____________________________________________________________ 12 II.1. MARCO TEÓRICO _____________________________________________ 12

PARTE III ___________________________________________________________ 29 III.1. RESULTADOS ________________________________________________ 29

III.2. DISCUSIÓN DE RESULTADOS ____________________________________ 39

PARTE IV ___________________________________________________________ 49 IV.1. CONCLUSIONES ______________________________________________ 49

IV.2. RECOMENDACIONES ___________________________________________ 50

IV.3. BIBLIOGRAFÍA _____________________________________________ 51

PARTE V ____________________________________________________________ 53 V.1. INFORME FINANCIERO ___________________________________ 53

vi

Índice de Gráficas

Gráfica No. 1 Comportamiento del peso según sexo durante el ensayo 403__________ 29

Gráfica No. 2 Comportamiento del peso según sexo durante el ensayo 412__________ 31

Gráfica No. 3Ensayo cometa rata expuesta a deltametrina, aceite mineral___________ 34

Gráfica No. 4 Ensayo cometa grupo control _________________________________ 35

Gráfica No. 5 Ensayo cometa grupo mediano expuesto a deltametrina, diesel_________ 36

Gráfica No. 6 Ensayo cometa grupo bajo expuesto a deltametrina, diesel____________ 37

Gráfica No. 7 Ensayo cometa grupo alto expuesto a deltametrina, diesel____________ 38

Índice de Tablas

Tabla No. 1 Distribución de grupos experimentales___________________________ 29

Tabla No. 2 Efectos predominantes de la toxicidad inhalatoria No. 403_____________ 30

Tabla No. 3 Efectos predominantes histológicos del ensayo No. 403______________ 31

Tabla No. 4 Efectos predominantes de la toxicidad inhalatoria No. 412_____________ 32

Tabla No. 5 Efectos predominantes histológicos del ensayo No. 412______________ 33

Índice de Fotografías

Fotografia No. 1 Efectos visibles de exposición en ensayo 403___________________30

Fotografía No. 2 Equipo de exposición inhalatoria, CH Technologies Inc.___________ 41

Fotografia No. 3 Electroforesis en gel de células individuales ___________________ 45

Fotografia No. 4 Extracción de sangre periférica_____________________________ 46

Fotografia No. 5 Microscopio de campo oscuro del Depto. de Citohistología_______ 48

vii

Índice de Imágenes

Imagen No. 1Daño al ADN_____________________________________________ 24

1

RESUMEN

El objetivo primario de este trabajo fue evaluar el daño genotóxico en células sanguíneas de

ratas expuestas al piretroide deltametrina, utilizado ampliamente en el territorio nacional, tanto

dentro como fuera de las viviendas en el control de vectores, a fin de obtener información

sobre el riesgo en la utilización de este piretroide empleado en conjunto con diesel como

disolvente.

Para evaluar el daño primario al ADN se utilizó la técnica de electroforesis para células

individuales, conocida como ensayo cometa. Este es un ensayo genotóxico utilizado para

evaluar células expuestas a diversos contaminantes ambientales, su fundamento se basa en el

potencial del agente químico de unirse a macromoléculas como el ADN y provocar

modificaciones en la información genética, esta prueba específica mide las roturas de las

cadenas del ADN por unidades arbitrarias en cada célula.

La investigación se desarrolló realizando el test de toxicidad inhalatoria aguda de la

Organization for Economic Cooperation and Development OECD, guía 39 y 403, el cual

permite reducir el número de animales de experimentación y obtener datos sobre letalidad del

piretroide y el diesel como disolvente del mismo, obteniendo que los machos son más sensibles

al compuesto químico y por lo tanto se descartó la utilización de hembras en las siguientes fases

del estudio.

También se realizó el test de la Guía 412 de la OECD para toxicidad inhalatoria sub aguda a

dosis repetidas por 28 días, para esto se realizaron cuatro grupos; tres grupos, cada uno con una

diferente concentración utilizando deltametrina con diesel como disolvente y un grupo de

deltametrina con aceite mineral como disolvente, como comparación. A estos grupos se les

realizó el ensayo cometa obteniendo resultados significativos de daño primario al ADN en las

tres concentraciones, y sin daño para el grupo en el que se utilizó aceite mineral como

disolvente. Adicionalmente los animales fueron sacrificados y evaluados histológicamente en la

unidad de patología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, donde se encontró

daño en hígado, riñón y pulmón de todos los animales expuestos a diesel como disolvente,

comparado con los animales expuestos a deltametrina con aceite mineral como disolvente, que

presentaron daño menor, y los animales control que no presentaron daño aparente.

2

Summary

The primary objective of this study was to evaluate the genotoxic damage in single cells of

rats exposed to deltamethrin, used inside and outside homes in vector control, in order to obtain

information on the damage caused by using this pyrethroid diesel is used together with solvent.

The primary damage to DNA was evaluated used electrophoresis technique was used for

individual cells, known as comet assay. This is a test used to assess genotoxic cells exposed to

environmental pollutants, its foundation is based on the potential of the chemical to bind to

macromolecules such as DNA and cause changes in the genetic information specific test

measures the strand breaks of DNA in each cell arbitrary units.

The research evaluated the acute inhalation toxicity test of the organization for economic

cooperation and development OECD, guide 39 and 403, which reduces the number of

experimental animals and obtain data on lethality of pyrethroid and diesel as a solvent of the

same, obtaining that males are more sensitive to the chemical and therefore discarded females

using the following phases of the study.

We used test OECD 412 Guide for acute inhalation toxicity repeated dose for 28 days, for

this there were four groups, three groups, each with a different concentration using deltamethrin

with diesel as a solvent and a group of deltamethrin mineral oil as solvent comparison. These

groups underwent significant comet assay results obtained primary DNA damage in the three

concentrations and without damage to the group in which mineral oil was used as solvent.

Additionally, the animals were sacrificed and evaluated its organs pathology unit of the Faculty

of Veterinary Medicine, where damage was found in liver, kidney and lung of all animals

exposed to diesel as a solvent, compared to animals exposed to deltamethrin with mineral oil as

a solvent, which had minor damage, and control animals showed no damage.

3

PARTE I

I.1. INTRODUCCIÓN

Guatemala es un país endémico en vectores de malaria, dengue, entre otros, por lo cual el

uso de plaguicidas que controlen a estos vectores es común, así como necesario, y son

utilizados en todos los departamentos del país exceptuando a Totonicapán.

Desde hace muchos años en Guatemala como en otros países de la región se utilizan piretroides

para estos fines, como es el caso de la deltametrina, que se combina con diesel como disolvente,

aunque de acuerdo a los fabricantes este piretroide puede mezclarse otros disolventes oleosos

como el aceite mineral, e incluso el agua, pero en concentraciones que no se consideran

efectivas para el combate de los vectores en las condiciones nacionales. (Ficha técnica).

Estos plaguicidas han sido sujetos de desconfianza por algunos sectores de la población, y

en un estudio epidemiológico anterior se evidencia un factor de riesgo estadístico en el

desarrollo de la Leucemia Linfoblástica Aguda, si se está expuesto a estos plaguicidas, sin

embargo estos datos deben ser confirmados experimentalmente (Vargas, 2009).

El presente estudio fue un estudio experimental donde se evaluó el riesgo a exposición de

deltametrina en animales de laboratorio, permitiendo evaluar la existencia de daño primario al

ADN en células sanguíneas de las ratas; se llevaron a cabo dos ensayos toxicológicos en donde

se comparó el uso de diesel y el aceite mineral como disolventes.

Aunque el diesel es considerado por la IARC un compuesto cancerígeno, este es

considerado de esta manera en combustión, no en usos como disolvente por lo que no es posible

inferir la extrema toxicidad de este disolvente, sin embargo el fabricante no recomienda el uso

del mismo, por lo que sugiere utilizar aceite mineral.

En Guatemala, el uso de diesel como disolvente representa una mala práctica en el uso de

deltametrina, sin embargo con este estudio tuvo como objetivo determinar el riesgo al estar

expuestos a dicha mezcla.

Para este fin, se seleccionó como método de exposición la de cuerpo completo del animal,

siendo necesaria la utilización de una cámara de biocontención, con capacidad para grupos de 5

animales, donde a través de un colisionador fue administrado el plaguicida con disolvente en

forma de aerosol, administrándose de manera constante por 4 y 6 horas, durante 14 y 28 días

respectivamente; con un flujo continuo de 6 litros de aire por minuto.

El ensayo cometa consistió en extraer sangre periférica de la cola de cada animal, realizando a

cada uno por triplicado el ensayo utilizando electroforesis en gel, observándose en microscopía

de fluorescencia con bromuro de etidio, analizando de forma individual. Las células

encontradas mostraron daño, siendo proporcional según la concentración utilizada, el grupo que

fue expuesto al plaguicida con aceite mineral como disolvente no mostro daño primario al ADN

en las células individuales.

4

I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

En Guatemala el combate a los vectores de dengue y malaria es constante a través de

compuestos químicos piretroides que se aplican dentro y fuera de las viviendas donde se

reportan mayor incidencia de casos de este tipo.

El control de estos vectores ha sido satisfactorio en Guatemala donde aunque los casos son

endémicos existe una fumigación constante a manera de prevención de estas enfermedades.

La aplicación dentro y fuera de las viviendas de estos plaguicidas se realiza disolviendo el

piretroide en diesel, la concentración de estos varía en función del lugar, sin embargo la

etiqueta señala que la concentración debe ser 1 parte de deltametrina por 65 partes de

disolvente.

Sin embargo estas aplicaciones de plaguicidas han conllevado a dudas por parte de la

población, puesto que no existen estudios en Guatemala que confirmen la inocuidad de estos

compuestos químicos que se aplican recurrentemente.

En Guatemala un estudio realizado en Quetzaltenango reporto que hay un riesgo 11.5 veces

mayor de desarrollar LLA, al estar expuesto a plaguicidas cerca del hogar, en este estudio se

reporta que el 50% de las fumigaciones cercanas al hogar provenían de piretroides utilizados en

el control de vectores con diesel como disolvente (Vargas, 2009).

El ensayo cometa es un ensayo genotóxico que permite evaluar in vivo el daño primario al

ADN, por exposición a contaminantes en el ambiente. Este ensayo se utilizó en ratas Wistar,

previamente expuestas a piretroides con disolvente diesel y aceite mineral, bajo un estudio de

toxicidad inhalatoria de cuerpo completo del animal.

5

I.2.1. ANTECEDENTES

La existencia de estudios toxicológicos de plaguicidas en Guatemala es nula, sin embargo

existen investigaciones que evidencian el uso inadecuado de plaguicidas en el país, y valores de

colinesterasa en personas que utilizan plaguicidas como medida de seguridad laboral

(PLAGSALUD).

En un estudio donde se realizaron determinaciones en muestras de orina, este como una

propuesta de un método no invasivo para medir la exposición a formulaciones con deltametrina,

particularmente aquellas que contienen xileno y mesitileno como solventes. Obteniendo

resultados no tóxicos obtenidos a través de la orina y al test de mutagenicidad (Moretti, 1997)

En otro estudio indica que la deltametrina, en la presencia de la activación metabólica

(+S9), es capaz de inducir daño al ADN (rotura simple y doble de las cadenas, sitios lábiles

alcalinos y sitios de reparación por escisión abiertos) como se observó por el incremento de los

valores del momento de cola observados con un incremento de las dosis (Villarini, 1998).

Se realizó un estudio experimental en el cual se estableció que la asociación entre

deltametrina y los efectos en la infertilidad se observaron en los ratones Swiss, observaron una

pérdida de la post-implantación a dosis medias y altas de deltametrina. Al igual observaron un

ligero incremento en la tasa de mutaciones letales dominantes esto asociado al aumento de

dosis de deltametrina en semanas tempranas, pero que disminuía en semanas tardías, por lo que

aparentemente no se observó una dosis respuesta (Shukla, 2000).

Un estudio experimental observó que los grupos tratados con deltametrina decreció

significativamente comparada con el grupo control; llegando a la conclusión que la exposición

a altas dosis de deltametrina en ratas hembras en estado de lactancia puede disminuir la

actividad de NOS en el cerebro y retardar el desarrollo neuronal y comportamiento de las crías

(Li, 2006).

Incluso se adjudica que los diferentes piretroides afectan de diversas formas, en el estudio

se demostró que la liberación y captación de DA son afectadas diferencialmente por el tipo I y

el tipo II de piretroides indicando que el circuito dopaminérgico, la DA estriatal en particular,

puede ser por un piretroide objetivo y que los piretroides pueden estar actuando en la DA

estriatal por múltiples mecanismos (Hossain, 2006).

Además de los efectos que se describen también se adjudican alteraciones en el sistema

endocrino, la cual puede originarse por una exposición simultánea a diferentes insecticidas

ocasionando componentes disruptores que contribuyen al deterioro observado en la salud

reproductiva masculina (Kilian, 2007)

Por medio del ensayo cometa se observó que la exposición del etilmetanosulfonato y

acrilamida inducen un incremento significativo en el daño al ADN, esto se observó en múltiples

tejidos de ratas y ratones. Este estudio en base a sus resultados indica que el ensayo cometa

provee mayores resultados compresivos de compuestos potencialmente genotóxicos (Recio,

2009).

6

Por otro lado un estudio realizado con anterioridad establece un riesgo estadístico de

OR=11.5 a desarrollar Leucemia Linfocítica Aguda por exposición a plaguicidas dentro y fuera

del hogar. Siendo los principales plaguicidas a los que se refiere el estudio, el piretroide

utilizado por control de vectores en Guatemala (Vargas, 2009).

En relación a la neurotoxicidad, un estudio publicó que la elevada exposición de un cerebro

inmaduro a los piretroides puede proveer una consecuencia de toxicidad a largo plazo, como

también una a corto plazo (Kim, 2010).

7

I.2.2. JUSTIFICACIÓN DEL TRABAJO DE INVESTIGACIÓN

La exposición de contaminantes ambientales y sus consecuencias en salud pública, es una

de las preguntas que deben responderse siguiendo un criterio científico.

En Guatemala, un país donde se utilizan plaguicidas para el control de vectores de manera

constante, es importante utilizar estos de la manera más adecuada, uno de los plaguicidas

utilizados es el piretroide deltametrina para el control del dengue, siendo ampliamente utilizado

en los 22 departamentos del país. Este piretroide debe utilizarse con un vehículo idealmente un

solvente oleoso, sin embargo observaciones de campo refieren que este plaguicida es

combinado con diesel como disolvente, lo que genera una pregunta de investigación respecto a

su toxicidad inhalatoria en conjunto, debido a que existe evidencia científica que refiere un

riesgo toxicológico de este plaguicida, al aplicarse inadecuadamente en combinación con agua,

aceite mineral y otros solventes oleosos; sin embargo, en asociación con otras sustancias como

el diesel que actualmente es catalogado por la IARC como cancerígeno, no existen estudios

que determinen si existe o no un riesgo en su uso.

Por lo anterior se realizó el ensayo cometa el cual es una técnica para evaluar el daño

primario al ADN por exposición a diversos contaminantes ambientales. El ensayo cometa es un

método útil y práctico para evaluar aspectos genotóxicos, como la rotura en las cadenas de

ADN derivadas por exposición a uno o varios contaminantes ambientales.

El presente estudio de genotoxicidad, es la continuidad a los estudios epidemiológicos

anteriores que señalan la posible implicación de estos activos en patologías como la LLA,

siendo el principal cáncer que afecta a niños entre 0 y 14 años en Guatemala.

La importancia de la realización de estudios experimentales que concluyan la existencia de

daño primario al ADN, es la posibilidad de prevenir posibles patologías que se presenten en

guatemaltecos expuestos, y así contribuir a la salud preventiva, por medio del rigor científico, a

través de recomendaciones a los aplicadores de estos plaguicidas, basados en datos de este

estudio.

8

I.3. OBJETIVOS E HIPÓTESIS

I.3.1. Objetivos

I.3.1.1. Objetivo General

Determinar y evaluar el daño primario al ADN, por ensayo cometa en células sanguíneas

de ratas expuestas a piretroides con diesel como disolvente, que se utilizan para control de

vectores en Guatemala.

I.3.1.2. Objetivos Específicos

Determinar y evaluar el daño primario al ADN, por ensayo cometa en células sanguíneas

de ratas expuestas a piretroides con diesel como disolvente, que se utilizan para control de

vectores en Guatemalay comparar el daño primario ocasionado con otros disolventes de

elección.

Determinar y evaluar la dosis letal 50 DL50, en ratas expuestas a piretroides con

disolvente diesel y agua.

Exponer y evaluar ratas a piretroides con disolvente diesel y agua por medio del ensayo

de toxicidad inhalatoria a dosis repetida OECD No.412.

Determinar y evaluar el daño al ADN en células sanguíneas por medio del ensayo cometa

en ratas expuestas a piretroides.

Comparar resultados obtenidos entre los grupos y determinar el grado de daño primario al

ADN por exposición a estos piretroides en dependencia al tipo y concentraciones de los

disolventes utilizados.

I.3.2. Hipótesis

La exposición inhalatoria a dosis repetidas de piretroides utilizados en Guatemala, con

diesel como disolvente ocasiona un daño genético en células sanguíneas en ratas.

9

I.4. METODOLOGÍA

I.4.1. Localización:

El presente estudio fue llevado a cabo en la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia,

en la Universidad de San Carlos de Guatemala, en las instalaciones del Bioterio del

Departamento de Farmacología de la Escuela de Química Farmacéutica. En dichas

instalaciones se llevó a cabo la fase experimental de la toxicidad inhalatoria hasta la toma de

muestra sanguínea de los animales.

El análisis celular del ensayo cometa fue llevado a cabo en el Área de Microscopía del

Departamento de Citohistología de Escuela de Química Biológica, situado en el segundo nivel

del Edificio T-11, Ciudad Universitaria.

El análisis histopatológico de los sujetos expuestos fue llevado a cabo en el Departamento

de Patología de la Facultad de Veterinaria y Zootecnia. Primer nivel, Edificio M-5, Ciudad

Universitaria.

I.4.2. Variables:

I.4.2.1. Variables dependientes: Daño primario al ADN

I.4.2.2. Variables independientes:

Exposición a piretroides

I.4.3. Indicadores:

I.4.3.1. Concentración del piretroide en la cámara de exposición

I.4.3.2. Informes histopatológicos

I.4.3.3. Signos presentes en los animales de experimentación

I.4.3.4. Medición del daño al ADN por el largo de la cola del cometa (ensayo cometa)

I.4.4. Estrategia metodológica:

I.4.4.1. Población y muestra: Ratas Wistar, hembras y machos escogidos aleatoriamente.

I.4.5. Método:

I.4.5.1. Toxicidad Inhalatoria Aguda, Protocolo No. 403(OECD, 2009)

Animales de Experimentación: Ratas Wistar.

Selección de especie: Al comienzo del estudio la variación de pesos entre los animales no

excedió del ± 20 % de la media.

Número y sexo: 10 animales (5 hembras y 5 machos) para cada grupo de prueba. Las hembras

fueron nulíparas y no-preñadas. Se retiró un animal del estudio por afecciones severas.

Acondicionamiento y alimentación (antes y después de la exposición): la temperatura de

la habitación en la que se encontraron los animales fue de 22º C (±3º C) y la humedad relativa

10

fue del 50 al 60%. La luz es artificial la secuencia de 12 horas luz, 12 horas oscuridad. Para la

alimentación, la dieta convencional se utilizó con agua y comida ilimitada. Los animales se

encontraban en grupos por sexo; no interfiriendo con la observación clara de cada animal.

Equipamiento: los animales fueron sometidos en un equipo de inhalación diseñado con

flujo dinámico de aire de 12 a 15 cambios por hora y se aseguró el contenido de oxígeno

adecuado y una exposición distribuida adecuadamente en la atmósfera. La cámara mantuvo una

ligera presión negativa interna que previno que la sustancia se libere en el área circundante. Se

utilizó un sistema de inhalación dinámico con un control analítico de concentración.

Procedimiento: ambos grupos fueron expuestos a la sustancia prueba a una concentración

de 1:1 durante 14 días por 4 horas diarias. Se observaron continuamente los efectos presentados

por los animales: comportamiento, peso, ingesta de la dieta, efectos (persistencia, disminución

o aumento de los mismos), posteriormente se realizó la necropsia y el análisis histopatológico.

I.4.5.2. Toxicidad Inhalatoria Subaguda: Protocolo No.412 (OECD, 2009)

Animales de Experimentación: Ratas Wistar.

Selección de especie: Al comienzo del estudio la variación de pesos entre los animales no

excedió del ± 20 % de la media.

Número y sexo: 5 animales (machos) para cada grupo de prueba haciendo un total de 20

animales. Se utilizó un grupo satélite de 4 animales (machos) con una alta concentración, no se

observó reversibilidad, y una persistencia de los efectos.

Acondicionamiento y alimentación (antes y después de la exposición): la temperatura de

la habitación en la que se encontraron los animales fue de 22º C (±3º C) y la humedad relativa

fue del 50 al 60%. La luz es artificial la secuencia de 12 horas luz, 12 horas oscuridad. Para la

alimentación, la dieta convencional se utilizó con agua y comida ilimitada. Los animales se

encontraban en grupos por sexo; no interfiriendo con la observación clara de cada animal.

Equipamiento: los animales fueron sometidos en un equipo de inhalación diseñado con

flujo dinámico de aire de 12 a 15 cambios por hora y se aseguró el contenido de oxígeno

adecuado y una exposición distribuida adecuadamente en la atmósfera. La cámara mantuvo una

ligera presión negativa interna que previno que la sustancia se libere en el área circundante. Se

utilizó un sistema de inhalación dinámico con un control analítico de concentración.

Procedimiento: ambos grupos fueron expuestos a la sustancia prueba a una concentración

de 1:65, 3:65, 0.5:65 de deltametrina: diesel y 1:65 de deltametrina: aceite mineral durante 28

días por 6 horas diarias. Se observaron continuamente los efectos presentados por los animales:

comportamiento, peso, ingesta de la dieta, efectos (persistencia, disminución o aumento de los

mismos), posteriormente se realizó la necropsia y el análisis histopatológico.

I.4.5.3. Daño primario al DNA por Ensayo Cometa Mediante la técnica descrita por

Collins, A.R., et al en 1997 (Dhawan, 2006)

Se obtuvo la muestra de sangre. Se preparó el microgel: los linfocitos son colocados en un

portaobjetos con una solución de agarosa 0.5-1%. Se produce una lisis celular con Tritón X-

100, y NaCl 2.5M.

11

El desenrrollamiento del DNA se realiza por incubación alcalina al supercoloide de DNA

con 0.3 M NaOH, 10 mM EDTA y posteriormente se realiza una electroforesis a 0.8V/cm por

30 minutos. Se neutralizaron todas las muestras y se tiñeron con Bromuro de Etidio EtBr.

Observándose en el microscópico y realizando el conteo individual de las células.

Registrándose fotográficamente como constancia de realización del análisis.

I.4.6. Tratamiento estadístico:

Los resultados observados de los ensayos de toxicidad inhalatoria aguda y subaguda

fueron registrados en el programa Epidat versión 4.6

Los resultados obtenidos del ensayo cometa fueron sometidos a un análisis mediante el

software Casp 1.2.2

Se utilizó estadística descriptiva, chi-cuadrado para determinar la asociación entre los

efectos genotóxicos y la concentración del plaguicida.

Se realizaron correlaciones tanto crudas como parciales.

12

PARTE II

II.1. Marco Teórico

Control de enfermedades transmitidas por vectores: uso de plaguicidas en ambientes

domiciliares

Los agentes patógenos transmitidos por vectores o que tienen huéspedes intermediarios se

encuentran entre las principales causas de enfermedad y muerte en muchos países tropicales y

subtropicales. Esas enfermedades, entre las que se incluyen la enfermedad de Chagas, el

dengue, la leishmaniasis, la filariasis linfática y la malaria, son un importante obstáculo al

desarrollo económico y social (WHOPES, 2001).

La lucha contra vectores desempeña un papel fundamental en la prevención y el control

de las principales enfermedades transmitidas por vectores, como la enfermedad de Chagas, el

dengue y la malaria, y a menudo constituye la primera línea de defensa ante las epidemias de

estas enfermedades (WHOPES, 2001).

El control de vectores es un componente importante en los programas de control de

diversas enfermedades ocasionadas por vectores. Esta implementación incluye objetivos,

métodos disponibles de sitios específicos, predicción en viabilidad técnica y operacional,

recursos e infraestructura. Estos deben ser aplicados de acuerdo con los principios integrados

del contexto local, racionalizando el uso de los métodos y de los recursos de control del vector

y acentúa la implicación de las comunidades (WHO, 2006).

Los plaguicidas utilizados para fines de salud pública son inocuos, costo eficaces y

operacionalmente aceptables. Los plaguicidas con los que se cuenta en el mercado de hoy,

deben de seguir una serie de requisitos para ser aceptados y utilizados para el programa de

control de vectores. Éstos requieren la selección adecuada; tanto el uso de ciertos principios

activos como las formulaciones, deben ser las más apropiados para la plaga (en cuanto a

resistencia del vector) y la modalidad de aplicación a las que estén destinados, garantizando la

seguridad de la población (WHOPES, 2002; WHO, 2010).

El control de vectores en Guatemala es importante ya que forma parte de las estrategias

de la salud preventiva. Para este programa se utilizan distintos plaguicidas, siendo el más

importante la deltametrina, un piretroide que se utiliza para el rociamiento de interiores, ya que

es un insecticida de acción residual (Vargas, 2009).

13

Piretroides:

Los piretroides son un grupo de pesticidas artificiales desarrollados para controlar

preponderantemente las poblaciones de insectos plaga. La obtención de piretrinas sintéticas

(denominadas piretroides, es decir, “semejantes a piretrinas”), se remonta a la fabricación de la

Aletrina en 1949. Desde ese entonces su uso se ha ido ampliando en la medida en que los

demás pesticidas eran acusados de alta residualidad, bioacumulación y carcinogénesis

(organoclorados) y por otra parte el alto efecto tóxico en organismos no plaga y en mamíferos

(carbamatos y organofosforados) (INCAP, Hayes, 1995).

Los piretroides, en cambio, no poseen estas desventajas y debido a las bajas cantidades

de producto necesarias para combatir las plagas su costo operativo es más que conveniente.

Debido a las ventajas antes señaladas, los piretroides son actualmente el plan con mayor

ventaja en el combate y control de vectores. Sus cualidades en este último campo, son su alto

poder de volteo y su baja acción en el hombre. Su acción, como casi todos los insecticidas, es a

nivel sistema nervioso, generando una alteración de la transmisión del impulso nervioso

(INCAP, Hayes, 1995).

Al contrario de los organoclorados, los carbamatos y los organofosforados, no existen

muchos casos de resistencia de insectos a piretroides. Sin embargo, como con todos los

insecticidas, recomiendan el uso moderado de los mismos alternando los distintos tipos de

insecticidas y usando las cantidades mínimas necesarias (INCAP, Hayes, 1995).

Los signos y síntomas de la toxicidad de los piretroides están divididos en dos grupos:

tipo I (conducta agresiva, hipersensibilidad por estímulos externos, temblores del cuerpo

completo, postración) que corresponden para piretroides como la aletrina, bioaletrina,

resmetrina, fenotrina. El grupo tipo II (patadas, salivación profusa, temblores fuertes,

coreoatetosis1, convulsiones clónicas) para piretroides como la deltametrina, fenvalerato,

cipermetrina, cihalotrina. Siendo el mismo mecanismo de acción en mamíferos como en

insectos, provocando una disrupción en el voltaje de los canales de sodio; los piretroides se

enlazan a la subunidad alfa de los canales de sodio y enlentecen la activación (apertura), como

también la tasa de inactivación (cierre) de los canales de sodio, dejando un estado

hiperexcitable de forma estable. Los canales de sodio se abren y son potencialmente

hiperpolarizados, y se mantienen abiertos durante más tiempo, permitiendo que más iones sodio

crucen y despolaricen la membrana neuronal (Curtis, 2008).

1Síndrome que se caracteriza por la presencia de movimientos incontrolados e involuntarios en

varias zonas corporales, con carácter de atetosis (posturas retorcidas, proximales y frecuentemente alternantes) y de corea (movimientos involuntarios, breves y finalidad aparente, especialmente de la cara y las extremidades distales). Está provocado por un trastorno de las vías motoras extrapiramidales.

14

Deltametrina

De acuerdo a la ficha técnica la deltametrina corresponde el nombre químico (IUPAC)

de: S-alpha-ciano-3-fenoxibenzil (1R)-cis-3-(2,2-dibromovinil)-2,2-dimetilciclopropanocarboxi

lato. Su fórmula química es C22H19Br2NO3 de masa molecular de 505.2g. N° CAS 52918-

63-5. En caso de incendio se desprende humos (o gases) tóxicos e irritantes. Deltametrina

es un piretroide compuesta de un isómero individual de 8 estereoisómeros preparados

selectivamente por la esterificación de ácido 2,2-dimetil-3-ciclopropanocarboxílico con -

alcohol o -alfa-ciano-3-fenoxibencil o por recristalización selectiva de los ésteres racémicos

obtenidos por esterificación del ácido con el racémico o-alcohol.

Es uno de los insecticidas más populares y ampliamente utilizados en el mundo y se han

convertido en muy popular con los operadores de control de plagas y de los individuos en los

Estados Unidos. Este material es un miembro de una de las clases más seguras de plaguicidas:

los piretroides sintéticos. Este pesticida es altamente tóxico para los organismos acuáticos,

especialmente el pescado, y por lo tanto se debe utilizar con extrema precaución en torno al

agua. Aunque generalmente se considera seguro para usar alrededor de los humanos, todavía es

neurotóxico para los seres humanos. Este es capaz de pasar de la piel de una mujer a través de

su sangre y en la leche materna.

Hay muchos usos para deltametrina, que van desde los usos agrícolas para el control de

plagas en casa. Ha sido fundamental en la prevención de la propagación de enfermedades

transmitidas por los perros de los sitios infestados con garrapatas, roedores y otros animales de

madriguera. Es útil en la eliminación y prevención de una amplia variedad de plagas

domésticas, especialmente arañas, pulgas, garrapatas, hormigas carpinteras, abejas de

carpintero, cucarachas y chinches. Es también uno de los ingredientes principales en tiza

hormiga.

Como se mencionó anteriormente, este pesticida, juega un papel clave en el control de

vectores, y se utiliza en la fabricación de mosquiteros insecticidas de larga duración. Se utiliza

como uno de una batería de insecticidas piretroides en el control de los vectores de la malaria,

en particular Anopheles gambiae, y siendo a la vez el insecticida piretroide más empleado, se

puede utilizar en conjunto con, o como una alternativa a permetrina, cipermetrina y otros

organofosforados basado insecticidas, como el malatión. La resistencia a la deltametrina es

ahora muy extendida y amenaza el éxito de los programas de control de vectores en todo el

mundo. La resistencia se ha caracterizado en varios insectos, entre ellos importantes vectores de

la malaria como el mosquito Anopheles gambiae, así como plagas no conductoras de

enfermedades como los chinches de cama.

15

Un determinante en el uso de la deltametrina, como control de vectores, fue que mostró

un mayor efecto en la disminución de índices de picadura intra y peridomiciliares y en los

índices de reposo en superficies rociadas en comparación con los otros dos insecticidas

(malatión y DDT). El análisis de costos indicó que la aplicación en bajo volumen de

deltametrina y malatión fue 2.56 veces mayor y 0.89 veces menor, respectivamente, que el

costo de la aplicación de DDT en forma adicional. El ahorro en costos, anudado a la eficacia y

utilidad práctica de esta técnica de rociado, la convierten en una alternativa viable para el

control de vectores (Vaca-Marín MA y col., 1991).

En el transcurso del uso de la deltametrina se han estudiado mecanismos de resistencia

ante su uso. Los métodos de resistencia incluyen el engrosamiento de la cutícula del insecto

para limitar la penetración del insecticida, la resistencia metabólica a través de la

sobreexpresión de metabolizar P450 glutatión-S-transferasa mono-y oxigenasas, y la resistencia

desmontables mutaciones del canal de sodio que hacen que la acción de los insecticidas

ineficaces, incluso cuando se administran conjuntamente con butóxido de piperonilo. La

caracterización de las diferentes formas de resistencia de los mosquitos se ha convertido en una

prioridad en los grupos de estudio de la medicina tropical, debido a la alta mortalidad de los que

residen en las zonas endémicas.

La deltametrina posee efectos nocivos a la salud tanto humana como al ecosistema, los

síntomas por exposición de acuerdo con la ficha técnica de seguridad, por inhalación provoca

una sensación de quemazón, tos, vértigo, dolor de cabeza, náuseas. Por contacto en piel,

presenta enrojecimiento, sensación de quemazón, picor. Por contacto en ojos, presenta

enrojecimiento, dolor. Si llegase a ingerirse pueden presentar dolor abdominal, vómitos.

Los efectos de exposición de corta duración: irrita los ojos, la piel y el tracto

respiratorio. Puede causar efectos en sistema nervioso, dando lugar a sensaciones faciales tales

como, picores, quemazón, punzadas.

Mientras que la deltametrina es fácil de usar y en algunos casos muy eficaz, siempre debe

ser tratado con precaución. Se debe aplicar de acuerdo a las instrucciones que vienen con el

insecticida. Cuando no se tiene cuidado, se puede producir intoxicación deltametrina. Debido a

que es una neurotóxica, ataca temporalmente el sistema nervioso de cualquier animal con el que

entra en contacto. Al tener contacto con la piel puede causar hormigueo o enrojecimiento de la

piel local a la aplicación. Si se toma a través de los ojos o la boca, un síntoma común es la

parestesia facial, que puede sentirse como diferentes sensaciones anormales, incluyendo,

entumecimiento parcial, "alfileres y agujas" quema la piel, gatear, etc. No hay informes que

indican que la intoxicación crónica de insecticidas piretroides causa daño neuronal motora o

enfermedad de la motoneurona. Sin embargo, en 2011, un caso fue publicado que demostró

patológicamente probado la muerte de las neuronas motoras en una mujer japonesa después de

la ingestión aguda masiva de pesticidas que contienen piretroides y organoclorados.

Recientemente, en Sudáfrica, se encontraron residuos de deltametrina en la leche materna, así

como el DDT, en un área que utiliza el tratamiento DDT para el control de la malaria, así como

los piretroides en la agricultura a pequeña escala. No existen antídotos y el tratamiento debe ser

sintomático, tal como fue aprobado por un médico. Con el tiempo, deltametrina es

16

metabolizado, con una rápida pérdida de toxicidad, y se hace pasar desde el cuerpo. Un centro

de control de envenenamiento se debe contactar en caso de un envenenamiento accidental.

Los casos de toxicidad han sido observados en el ganado, tras el uso de la preparación

de deltametrina agrícola en aplicación externa en el control de garrapatas. Los síntomas

aparecen 36 horas después de la aplicación, y se incluyen temblores musculares que conducen a

decúbito 12 horas después. Después de 12 horas, se produjo una recuperación espontánea y el

animal podría levantarse de nuevo, a pesar de los temblores musculares persistieron. La

temperatura de su cuerpo era entonces 38.3C.

Experimentación en animales de laboratorio

Como animal de laboratorio se entiende por cualquier animal vertebrado (ej., animales de

laboratorios tradicionales, animales de granja, animales silvestres y acuáticos) utilizado en

investigación científica, enseñanza o pruebas de laboratorio. Cuando es oportuno se hacen

excepciones o énfasis específicos sobre los animales de granja. Generalmente, cuando se utiliza este

término no incluyen específicamente los animales de granja empleados en investigación científica

agrícola o enseñanza superior, los animales silvestres o acuáticos estudiados en sus ámbitos

naturales ni tampoco a los animales invertebrados utilizados en investigación científica

(ILARCLSNRC, 1999).

La experimentación en los animales de laboratorio comienza en el momento en que se

inicia la preparación de un animal para su utilización y termina cuando ya no se va a hacer

ninguna observación ulterior. El uso de animales conducen a despejar incertidumbres y

desarrollar la ciencia, muy encaminada al mejoramiento de la salud humana (Saravia, 2005).

La manipulación de los animales que se utilizan en investigación se rige por normas

éticas las cuales están encaminadas al principio de Las Tres Erres: reemplazo, refinamiento y

reducción. Motivo por el cual, para el científico no es un requerimiento tener una muestra

estadísticamente significativa, sin dejar de lado el respeto al animal con que se trabaja,

reduciendo al mínimo el estrés o dolor causado, administrando un sacrificio menos doloroso

(OECD, 1996).

El uso de animales requiere de la constante observación de parámetros dentro del bioterio,

como puede ser el alojamiento, el espacio destinado para cada animal dentro de las jaulas, la

frecuencia de limpieza y el tipo de material del alojamiento. Deben de ser controladas las

fluctuaciones de luz, aire, ruido que pueden interferir en los resultados de las investigaciones.

Además de cumplir con el control de ingesta de alimentos y agua.

17

Los principios éticos internacionales que guían la investigación biomédica con

animales aplicados:

1. El avance del conocimiento biológico y el desarrollo de mejores medios para la

protección de la salud y el bienestar, tanto del hombre como del animal, requieren

recurrir a experimentación en animales vivos intactos de una gran variedad de especies.

2. Siempre que sean apropiados, deben usarse métodos tales como modelos matemáticos,

simulación en computador y sistemas biológicos in vitro.

3. La experimentación en animales solamente se debe realizar después de estudiar su

importancia para la salud humana o animal y para el avance del conocimiento biológico.

4. Los animales seleccionados para la experimentación deben ser de una especie y calidad

apropiada, y utilizar el mínimo número requerido para obtener resultados

científicamente válidos.

5. Los investigadores y demás personal nunca deben dejar de tratar a los animales como

seres sensibles y deben considerar como un imperativo ético el cuidado y uso apropiado

y el evitar o minimizar el desconfort, la angustia y el dolor.

6. Los investigadores deben presumir que procedimientos que causarían dolor en seres

humanos también causan dolor en otras especies de vertebrados, aún cuando todavía

falta mucho por saber sobre la percepción del dolor en los animales.

7. Todo procedimiento que pueda causar en los animales más que un dolor o una angustia

momentánea o mínima, debe ser realizado con sedación, analgesia o anestesia apropiada

y conforme con la práctica veterinaria aceptada. No se deben realizar procedimientos

quirúrgicos o dolorosos en animales no anestesiados paralizados por agentes químicos.

8. Cuando se requiera apartarse de lo establecido, la decisión no debe ser tomada

solamente por el investigador directamente involucrado, sino que debe ser tomada por

un cuerpo revisor convenientemente constituido. Estas excepciones no deben hacerse

solamente con fines de demostración o de enseñanza.

9. Al final del experimento, o cuando sea apropiado durante el mismo, los animales que

puedan sufrir dolor crónico o severo, angustia, desconfort, o invalidez que no pueda ser

mitigada, deben ser sacrificados sin dolor.

10. Los animales mantenidos con propósitos biomédicos deben tenerse en las mejores

condiciones de vida posibles. Normalmente el cuidado de los animales debería estar

bajo la supervisión de veterinarios con experiencia en la Ciencia de Animales de

Laboratorio. En todo caso se debe disponer de cuidado veterinario cuando sea

requerido.

11. El director del instituto o del departamento donde se usen animales es el responsable de

asegurar que los investigadores y demás personal tengan calificación apropiada o

experiencia para realizar procedimientos en animales. Debe proporcionar oportunidades

adecuadas de entrenamiento en servicio que incluyan la preocupación por un trato

humano y apropiado para con los animales que están bajo su cuidado.

18

Organizaciones Internacionales que rigen el uso con animales de laboratorio

Existen diversas instituciones a nivel internacional que dictan lineamientos a cumplir para

el trabajo con animales de experimentación, entre ellas podemos mencionar:

Se puede encontrar la “Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio,

auspiciada por el National Institutes of Health (NIH), USA, en sus diferentes versiones (la

última edición fue publicada por The National Academy Press, USA, 1996).

La “Directiva 86/609/CEE relativa a la Aproximación de las Disposiciones Legales,

Reglamentarias y Administrativas de los Estados Miembros de la Comunidad Económica

Europea respecto a la Protección de los Animales Utilizados para Experimentación y otros fines

Científicos”

La convención ETS 123 para la protección de animales vertebrados usados para

experimentación y otros propósitos científicos, adoptada por el Consejo de Europa, el cual tiene

fuerza de recomendación.

La UNESCO en París se proclamó en 1978 la “Declaración Universal de los Derechos de

los Animales”, cuyo texto fue revisado en 1989 por la Liga Internacional de los Derechos del

Animal.

Existen Recomendaciones Internacionales relacionadas específicamente con la Seguridad

en Trabajos con Animales como por ejemplo las descriptas en las publicaciones: ILAR/NRC,

USA, “Occupational Health and Safety in the Care and Use of Research Animals”, National

Academy Press, Washington, D.C., 1997 y CDC/NIH, USA, “Biosafety in Microbiological and

Biomedical Laboratories” 4th

Ed., US Government Printing Office, Washington, D.C., 1999.

Existen sobre categorización y educación y entrenamiento mínimo requerido por todas

las personas relacionadas con el cuidado y uso de animales de laboratorio, como por ejemplo

las elaboradas por la Federación Europea de Asociaciones de Ciencia de Animales de

Laboratorio (FELASA).

19

Guías de la OECD

En este proyecto se aplicaron las normas y pautas que regula la OECD a través de las

Guidelines for Testing of Chemical (OECD, 1996) además de respetar los principios éticos para

el uso de animales.

Por sus siglas en inglés Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económico

OCDE, es una organización intergubernamental en la que los representantes de los 30 países

industrializados de América del Norte, Europa y la región de Asia y el Pacífico, así como la

Comisión Europea, se reúnen para coordinar y armonizar las políticas, discutir temas de interés

común, y trabajar juntos para responder a los problemas internacionales. La mayor parte del

trabajo de la OCDE se lleva a cabo en más de 200 comités especializados y grupos de trabajo

compuestos por delegados de los países miembros. Los observadores de varios países con

estatuto especial en la OCDE, y de las organizaciones internacionales interesadas, asistir a

muchos de los talleres y otras reuniones de la OCDE. Comités y grupos de trabajo son

atendidas por la Secretaría de la OCDE, con sede en París, Francia, que se organiza en

Direcciones y divisiones. En Medio Ambiente, División de Salud y Seguridad Pública

documentos libres de cargo de cada diez series diferentes : Pruebas y Evaluación; buenas

prácticas de laboratorio y verificación de su conformidad; Plaguicidas y Biocidas; Gestión de

Riesgos; Armonización de la vigilancia reglamentaria en biotecnología; Seguridad de Nuevos

Alimentos y Piensos; Accidentes Químicos; Contaminantes y Registros de Transferencia;

Documentos de escenarios de emisiones y la seguridad de los nanomateriales fabricados.

Las directrices de la OCDE son revisados periódicamente a la luz de las consideraciones

de los avances científicos y de bienestar animal. El desarrollo de un método de inhalación

aguda de clase tóxica (ATC) para la inhalación, se consideró apropiado tras la adopción del

método ATC bucal revisado previamente. En diciembre de 2001 y la posterior supresión de la

pauta oral aguda tradicional prueba 401. La alternativa TG N º 436 sobre "Toxicidad aguda por

inhalación Agudo Clase Método-ATC Toxico" ofrece refinamiento y reducción mediante la

aplicación de medidas de serie y las concentraciones objetivo fijo para clasificar la toxicidad

artículo de prueba para la clasificación y el etiquetado, de acuerdo con el Sistema de las

Naciones Unidas Globalmente Armonizado (SGA) de clasificación y etiquetado de productos

químicos.

20

OECD Toxicidad Inhalatoria Aguda

Los estudios de toxicidad aguda por inhalación son los medios ideales para la

caracterización de los peligros agudos de inhalación, pero hay circunstancias en las que

requieren un estudio de toxicidad por inhalación no se justifica por razones humanitarias,

científicas o prácticas. Pruebas en GHS categoría 5 es generalmente desalentada y sólo debe

considerarse cuando hay una fuerte probabilidad de que los resultados de una prueba de este

tipo tendría una relevancia directa para la protección de la salud humana. Por regla general, las

pruebas deben hacerse a menos que existan razones de peso para no probar. La decisión de

probar o no probar debe considerarse sobre una base caso por caso, utilizando un enfoque de

ponderación de la evidencia. Pruebas agudas por inhalación no es necesario si la forma física

de un artículo de prueba, como se comercializa o se utiliza, se opone a cualquier exposición a la

inhalación humana (por ejemplo, el bloque sólido de metal, gránulos no friables, materiales

elásticos compuestos). Sin embargo, la toxicidad asociada con los efluentes de la termólisis o la

combustión de los productos de otro modo no inhalable puede estar sujeto a prueba.

Consideraciones Éticas en Animales de laboratorio: Ensayos de Toxicidad Aguda

Las consideraciones éticas deben de velar por que el diseño y realización de los procedimientos

además de tener relevancia para la salud humana y animal, proveer un avance en el

conocimiento y dar un bien de la sociedad (ILARCLSNRC, 1999), se debe garantizar que:

1. El uso de las especies, calidad y número apropiados de animales.

2. El evitar o reducir al mínimo la incomodidad, diestrés y dolor, siempre y cuando sea

compatible con una buena ciencia.

3. El uso apropiado de sedación, analgesia y anestesia

4. El establecimiento de metas y objetivos en el experimento

5. Brindar un manejo apropiado a los animales, dirigido y realizado por personas

calificadas

6. La conducción de experimentos en animales vivos sólo por, o bajo la, estricta

supervisión de personas calificadas y con experiencia

Existe la preocupación ética por el bienestar de los animales de laboratorio, que incluye el

alivio de la tensión y el sufrimiento. Además de permitir que para la clasificación de los

estudios de toxicidad aguda por inhalación que pueden proporcionar información importante

acerca de los peligros potenciales que pueden estar asociados con el uso de los productos de

consumo (por ejemplo, los biocidas de interior, latas de spray multiusos, productos de limpieza

en aerosol, incienso repelente de insectos, entre otros). Para este fin, los puntos finales no

letales en el extremo inferior de la curva de concentración - respuesta pueden ser tan útiles

21

como puntos finales letales. Siempre que este objetivo se puede lograr mediante el uso de

métodos de ensayo alternativos, que utilizan menos animales, dentro de lo posible debe

mantenerse y optar por este enfoque.

La guía revisada 403 utiliza menos animales que la versión de la 403 de 1981 y todos

ellos contienen un requisito para seguir la guía N º 19 de la OECD sobre puntos finales, lo que

debería reducir el sufrimiento total de animales utilizados en aguda pruebas de toxicidad por

inhalación. La guía 403 utiliza un estudio preliminar para reducir al mínimo el número de

animales necesarios.

En la utilización de animales de experimentación estos que muestren signos graves y

duraderos de angustia o dolor deberán ser sacrificados humanitariamente como se describe en la

Guía de la OCDE Documento No. 19. Al exponer los animales a un artículo de la prueba con

propiedades irritantes o corrosivos fuertes donde las concentraciones buscadas no deben inducir

irritación / efectos corrosivos severos, sin embargo, suficientes para extender la curva de

concentración - respuesta a los niveles que alcanzan el objetivo normativo y científico de la

prueba. Artículos de prueba que son irritantes para los ojos / de la piel también pueden ser

irritantes de las vías respiratorias a concentraciones de exposición altos. Debido a

marcadamente diferentes enfoques metodológicos, los resultados de las pruebas de

corrosividad para los ojos / de la piel no se pueden traducir fácilmente a concentraciones de

exposición por inhalación reales entregados en un período de tiempo especificado. Por lo tanto,

los artículos de prueba corrosivos deben ser evaluados y probados siguiendo la opinión de

expertos en un términos comparables en caso por caso.

Exposición de animales de laboratorio en técnicas de toxicidad inhalatoria

Los animales que sean utilizados en estas técnicas se seleccionan al azar, marcados para

su identificación individual y se mantienen en sus jaulas durante al menos 5 días antes del

comienzo de la prueba para permitir que se aclimaten a las condiciones de laboratorio. Aunque

varias especies de mamíferos de prueba se pueden usar, la especie preferida es la rata.

Se recomienda uso de cepas comunes de laboratorio. Si se utiliza otra especie de

mamíferos, el experimentador usualmente debe proporcionar una justificación de su selección.

Al comienzo de un estudio, ratas adultas jóvenes - deben utilizarse (aproximadamente 8 12

semanas de edad)

El intervalo de tiempo entre los grupos de tratamiento se determina por la aparición,

duración y gravedad de los signos tóxicos. Inicio de una exposición debe retrasarse hasta que

uno es razonablemente seguro del resultado de los animales tratados con anterioridad. La

exposición de los animales en la próxima baja o más alta concentración se debe basar en la

experiencia previa y el juicio científico.

22

Los animales deben ser observados con frecuencia durante el período de exposición. Tras

la exposición, las observaciones clínicas cuidadosas deben hacerse por lo menos dos veces en

el día de la exposición, o con mayor frecuencia si así lo indica la respuesta de los animales para

el tratamiento, y por lo menos una vez al día a partir de entonces durante el período posterior a

la exposición. Observaciones adicionales si los animales siguen presentando signos de

toxicidad. Las observaciones incluyen cambios en la piel y el pelo, los ojos y las membranas

mucosas, del aparato respiratorio, circulatorio, los sistemas nerviosos autónomo y central, la

actividad somato -motriz y patrones de comportamiento. La atención debe ser dirigida a la

observación de temblores, convulsiones, salivación, diarrea, letargo, sueño y coma.

El principio del ensayo de Toxicidad Inhalatoria a dosis repetida que dictamina la OECD

No. 403 y No.412 consisten en exponer diversos grupos de animales de experimentación

diariamente en un periodo definido para probar la sustancia en concentraciones graduales, una

concentración por grupo, por un período de 14 o 28 días respectivamente. Donde un vehículo es

usado para ayudar a generar una concentración apropiada de la sustancia en la atmosfera, se

utilizan un grupo control del vehículo. Durante el periodo de administración los animales son

observados diariamente para detectar signos de toxicidad.

Abordaje a la toxicología general

La toxicidad aguda se debe a la presencia de los efectos inmediatos o mediatos por dosis

altas o dosis repetidas en un breve lapso de tiempo, pueden desembocar en la muerte o en una

incapacidad grave. No obstante, en algunos casos la intervención puede producir efectos

transitorios y totalmente reversibles. El resultado estará determinado por la dosis o por la

gravedad de la exposición (Curtis, 2008).

Cuando se administra una dosis única y elevada, algunas sustancias químicas no

presentan el mismo mecanismo de toxicidad que cuando se administran repetidamente en dosis

bajas pero tóxicas, comprendiendo como una toxicidad crónica. Cuando se administra una dosis

única y elevada cabe siempre la posibilidad de que se supere la capacidad de la persona para

destoxificar o excretar la sustancia, y ello puede provocar una respuesta tóxica distinta de la que

se produce cuando se administran repetidamente dosis más bajas. Un buen ejemplo a este

respecto es el alcohol, a dosis altas de alcohol producen efectos primarios en el sistema

nervioso central, mientras que la repetición de dosis más bajas (crónico) produce lesión

hepática (DeMarini & Huff, 2001).

Los plaguicidas organofosforados, por ejemplo, tienen en su mayoría escasa toxicidad

para los mamíferos hasta que son activados metabólicamente, sobre todo en el hígado. El

principal mecanismo de acción de los organofosforados es la inhibición de la acetilcolinesterasa

(AChE) en el cerebro y el sistema nervioso periférico. La AChE es la enzima que normalmente

pone fin a la estimulación provocada por el neurotransmisor acetilcolina. La inhibición leve de

la AChE a lo largo de un período prolongado no se ha asociado con efectos adversos. A niveles

23

de exposición altos, la incapacidad de poner fin a esa estimulación neuronal produce una

sobreestimulación del sistema nervioso colinérgico, lo que en última instancia provoca toda una

serie de síntomas, como parada respiratoria a la que sigue la muerte si no se trata (Watanabe,

2001).

La DL (dosis letal) es la dosis que produce una mortalidad del 50 % en una población

animal. La DL50solía considerarse en la bibliografía más antigua como una medida de la

toxicidad aguda de las sustancias químicas. A mayor DL50, menor toxicidad aguda. De una

sustancia química muy tóxica (con una DL50baja) se dice que es potente. No hay una

correlación necesaria entre la toxicidad aguda y la toxicidad crónica. La DE (dosis efectiva) es

la dosis que produce en el 50 % de los animales un efecto específico no letal.

Nociones de genética toxicológica:

La genética toxicológica o genotoxicología, es una rama de la toxicología que evalúa los

efectos de diversos agentes químicos y físicos en el material hereditario AND y en los procesos

genéticos de células vivas. Existen diversas metodologías que evalúan directamente la

interacción de los agentes con el ADN e indirectamente como pueden ser mutaciones genéticas

o alteraciones cromosómicas. Todos los cambios sufridos en el ADN tienen impactos directos

en la salud que se evidencian en la salud humana como alteraciones o desordenes genéticos que

pueden ser desde defectos al nacer y cáncer (Curtis, 2008).

La toxicología genética es, por definición, el estudio de la forma en que agentes químicos

o físicos afectan al complejo proceso de la herencia. Las sustancias químicas genotóxicas son

compuestos capaces de modificar el material hereditario de las células vivas. La probabilidad

de que una determinada sustancia cause un daño genético depende inevitablemente de diversas

variables, como el nivel de exposición del organismo a la sustancia, la distribución y retención

de ésta una vez que ha penetrado en el cuerpo, la eficiencia de los sistemas de activación

metabólica y/o destoxificación en los tejidos diana y la reactividad de la sustancia o de sus

metabolitos con macromoléculas críticas de las células. La probabilidad de que el daño genético

produzca una enfermedad depende en última instancia de la naturaleza del daño, la capacidad

que posee la célula de reparar o amplificar el daño genético, la oportunidad de expresar

cualquier alteración que se haya inducido y la capacidad del cuerpo de reconocer y suprimir la

multiplicación de células aberrantes (Misra & Walkees, 2001).

24

Mecanismos de inducción de alteraciones genéticas:

Los mecanismos que inducen alteraciones genéticas pueden darse por daño directo al

ADN por radiaciones ionizantes y no ionizantes, luz ultravioleta agentes químicos y endógenos,

que pueden llegar a producir roturas de una o las dos hebras, cruce entre las bases del ADN o

entre las bases y las proteínas, adiciones de elementos químicos en las bases del ADN

(aductos), producción de especies de oxígeno reactivo (superóxido, radicales libres de

hidróxido y peróxido de hidrógeno). Pueden presentarse daños en el momento de la reparación

del ADN dañado, durante la reparación si el daño al ADN es extensivo la célula muerte por

apoptosis. Si el daño es menos severo puede ser reparado por una serie de procesos que forman

parte de una respuesta al daño al ADN

que lleva al ADN a un estado sin daño,

llevado a cabo por familias de

polimerasas. Pero que al fallar esta

respuesta puede generar la formación

de mutaciones genéticas que pueden

ser en células somáticas (aberraciones

cromosómicas estructurales, cambios

en el número de cromosomas, cambios

en las cromátidas hermanas), o en

células germinales, que presentan

cambios similares a las células

somáticas. (Curtis, 2008).

Las primeras teorías sobre la

forma en que las sustancias químicas

interactúan con el ADN se remontan a

los estudios que se realizaron durante

el desarrollo del gas mostaza con fines

bélicos. Se amplió después el

conocimiento de estos procesos

cuando se trató de identificar agentes

anticarcinógenos que detuvieran

selectivamente la replicación de

células tumorales en rápida división.

La mayor preocupación de la opinión

pública por los peligros ambientales ha

impulsado nuevas investigaciones sobre los mecanismos y consecuencias de la interacción de

sustancias químicas y material genético (Misra & Walkees, 2001).

25

Existen diversos ensayos para detectar las alteraciones genéticas que van desde la

caracterización de las mutaciones genéticas hasta las ensayos que evalúan un punto final único

(por ejemplo existen ensayos donde se evalúa la reserción del triptófano WP2 de la E. coli

(Curtis, 2008).

Medición del daño primario al ADN:

Se trata de evaluar la capacidad que tienen los agentes de inducir cualquiera de los tres

tipos generales de cambios (o mutaciones) que puede sufrir el material genético (ADN):

cambios génicos, cromosómicos y genómicos. En organismos como los humanos, los genes se

componen de ADN, que consta de una serie de unidades llamadas bases de nucleótidos. Los

genes están organizados en estructuras físicas discretas que se denominan cromosomas. La

genotoxicidad puede producir efectos importantes e irreversibles sobre la salud humana. El

daño genotóxico es un paso crítico en la inducción del cáncer y puede intervenir también en la

inducción de defectos de nacimiento y muerte fetal. Las tres clases de mutaciones que se han

mencionado pueden producirse en cualquiera de los dos tipos de tejidos que poseen los

organismos como el ser humano: los espermatozoides y óvulos (células germinales) y el tejido

restante (células somáticas).

Los ensayos que miden la mutación génica son los que detectan la sustitución, adición o

supresión de nucleótidos en un gen. Los ensayos que miden la mutación cromosómica son los

que detectan rupturas o reordenaciones cromosómicas en las que intervienen uno o varios

cromosomas. Los ensayos que miden la mutación genómica son los que detectan cambios en el

número de cromosomas, fenómeno que se denomina aneuploidía. La evaluación de la toxicidad

genética ha cambiado mucho desde que Herman Müller desarrolló en 1927 el primer ensayo de

detección de agentes genotóxicos (mutágenos). Desde entonces se han desarrollado más de 200

ensayos que miden las mutaciones del ADN; no obstante, no llegan a diez los que normalmente

se utilizan hoy para evaluar la toxicidad genética.

Existen tres razones fundamentales que justifican la preocupación por la exposición del

hombre a los agentes mutagénicos.

Primero, el incremento en el grado de mutación de las células germinales (óvulos,

espermatozoides y sus precursores) lo cual puede provocar un aumento de la incidencia de las

enfermedades genéticas en futuras generaciones. Segundo, la existencia de una estrecha

relación entre la inestabilidad genómica de células somáticas con el cáncer y las enfermedades

degenerativas crónicas. Tercero, el origen ambiental del cáncer. Ello orienta a la utilización de

ensayos a corto plazo los cuales, informan en poco tiempo acerca de la actividad mutagénica de

dichas sustancias y en algunos casos brindan información suficiente para establecer los niveles

de seguridad para el hombre (Arencibia, 2003).

26

Fundamento del ensayo cometa

Ostling y Johanson en el año 1984, fueron los primeros en desarrollar una técnica de

electroforesis en microgeles para detectar el daño al ADN a nivel de células individuales. En

esta técnica las células son embebidas en agarosa y son añadidas en láminas de microscopio

para ser sometidas a una electroforesis neutral, tras la lisis en presencia de sales y detergentes.

Las células que tienen una elevada frecuencia de rupturas de doble cadena se movían

significativamente hacia el ánodo. En general el principio básico del ensayo, es la migración del

ADN en una matriz de agarosa bajo condiciones de electroforesis. Luego, al ser observada la

célula al microscopio (por fluorescencia, en el caso de este experimento), presenta la apariencia

de un cometa, con una cabeza (región nuclear) y cola (formada por fragmentos nucleares que

han migrado en dirección del ánodo) por lo que este ensayo es también conocido como ensayo

Cometa, debido al patrón de migración del ADN que se produce en las células dañadas. La

detección de la migración del ADN alterado depende de varios parámetros, tales como: la

concentración de la matriz de agarosa, el pH, la temperatura y duración del desenrollamiento,

voltaje, amperaje y duración de la electroforesis. El protocolo de este ensayo ha sufrido

diversas modificaciones a través del tiempo, y su objetivo establecido es para detectar daño al

ADN, específicamente aquellos producidos por las rupturas de cadena, la formación de sitios

lábiles al álcali, los entrecruzamientos ADN-ADN y ADN-proteínas y más recientemente para

la evaluación de los mecanismos de reparación de daño oxidativo en el ADN en células

eucariotas obtenidas tanto de estudios in vivo como in vitro.

Comparado con otros ensayos de genotoxicidad, el ensayo Cometa se distingue por su

(Arencibia, 2003):

1. Demostrada sensibilidad para detectar bajos niveles de daño al ADN (0.01 Gy),

2. Rápida realización (resultados en pocos días),

3. Análisis de los datos a nivel de células individuales,

4. Requiere un pequeño tamaño de muestra (pocas células),

5. Flexibilidad y bajo costo,

6. Aplicable a cualquier población de células eucariotas.

Este ensayo cometa, se utiliza la electroforesis comúnmente utilizada para el estudio de

proteínas y ácidos nucleicos, técnica que ayuda en el estudio del movimiento de biomoléculas

con una carga neta a través de un campo eléctrico. En la electroforesis la migración depende de

la forma, tamaño, carga y composición química; es utilizada para analizar y determinar el peso

molecular de diferentes tipos de biomoléculas. Existen diversos tipos de electroforesis cuya

diferencia radica en los distintos tipos de medios de soporte: lso geles de celulosa son usados

para moléculas de bajo peso molecular como los aminoácidos y los carbohidratos, los geles de

poliacrilamida y agarosa se utilizan para moléculas de mayor peso molecular (ADN, ARN y

proteínas). Los geles de electroforesis pueden ser horizontales, verticales o cilíndricos. Son

27

útiles para lograr la separación de componentes de mezclas complejas. Se aplican pequeñas

cantidades de la disolución de proteínas a un soporte sólido, que se impregna con una solución

de tampón. Los soportes son en general polímeros y forman un gel poroso que restringe el

movimiento de las moléculas a través del medio durante la electroforesis y disminuyen los

flujos de convección del solvente. Como soportes han sido utilizados papel (celulosa), almidón,

poliacrilamida, agarosa, acetato de celulosa, etcétera (Morales & Gallo, 2006).

Este método tiene gran poder resolutivo (técnica electroforética) porque se aplica una

cantidad pequeña de proteína a una zona estrecha, mientras que la longitud del trayecto es

mucho mayor que la zona de aplicación. El equipamiento requerido es simple (fuente de poder

y cubeta vertical u horizontal donde se coloca el soporte y 2 electrodos). Con el desarrollo de la

ciencia se han diseñado y existen diversos equipos automatizados de electroforesis. Además

existen diversos factores que deben de tomarse en cuenta para realizar la técnica de

electroforesis, siendo algunos parámetros: Diferencia de potencial (V): este potencial se mide

en voltios y es lo que define el campo eléctrico, cuanto mayor sea, mayor será la velocidad de

migración; las electroforesis se consideran de bajo voltaje si se realizan entre 10-500 voltios (la

mayoría) y de alto voltaje si se realizan entre 500-10,000 voltios. La intensidad (I) que se mide

en amperios y cuantifica el flujo de carga eléctrica, está relacionada con la diferencia de

potencial por la Ley de Ohm: V=IR y para una diferencia de potencial dada, su valor

(normalmente entre 5-50mA) viene determinado por la resistencia del soporte, por lo que, en

última instancia, da cuenta de la distancia recorrida por las moléculas. La resistencia (R) que se

mide en ohmios y cuanto mayor sea la resistencia del soporte, menor será la movilidad

electroforética (ya que la intensidad ha de ser menor para que se cumpla la Ley de Ohm),

depende de la naturaleza del soporte, sus dimensiones (anchura, longitud y sección) y de la

concentración del tampón de electroforesis. La temperatura, por el efecto Joule, el paso de una

corriente eléctrica produce calor, y este efecto será tanto mayor cuanto mayor sea la diferencia

de potencial y la resistencia del sistema; este debe controlarse de forma estricta, puesto que

puede afectar a la muestra (desnaturalizándola), al soporte e incluso al equipo electroforético

(Morales & Gallo, 2006).

El ensayo del cometa ha demostrado ser una técnica muy sensible a la hora de evaluar

daño en el DNA en una amplia variedad de células, dañadas por distintos agentes tanto físicos

como químicos, detectando entre 50 y 15000 rupturas por células. Este permite establecer

relaciones dosis-respuesta a bajas dosis, es capaz de detectar daño genético y su reparación en

moléculas de ADN altamente compactadas con eficacia y exactitud. Este ensayo se puede

medir en un gran número de células y en diferentes tejidos, los datos son obtenidos a nivel

individual donde pueden generar información sobre la heterogeneidad de una muestra (Zúñiga,

2009).

El ensayo cometa es una prueba que permite evaluar el daño primario al ADN,

evaluando la ruptura de las cadenas de ADN por exposición a contaminantes ambientales, este

ensayo permite evaluar si existe un daño primario al ADN por exposición a piretroides que

28

utilizan diesel como disolvente y enseguida comparar el daño producido entre los piretroides

utilizados con diesel versus el daño provocado utilizando un solvente adecuado según la

etiqueta. El ensayo cometa es un ensayo que mide la alteración al ADN visiblemente como una

cola de cometa en el microscopio de fluorescencia en campo oscuro, la ruptura de cadenas

como lo es el daño primario al ADN es el punto de partida para un daño clastogénico expresado

a nivel celular como aberraciones cromosómicas. (Dhawan, 2008; Valverde, 2009)

Es ampliamente utilizado para evaluar el daño genotóxico inducido por distintos

agentes, y su atención en mutagénesis y biomonitoreo ambiental parece incrementarse con el

desarrollo de las continuas mejoras que se van implementando. No obstante, uno de los puntos

críticos es la no uniformidad de la electroforesis que aporta variabilidad a los resultados y

también por la preparación de los microgeles respectivos (Crespo, 2011).

29

PARTE III

III.1. Resultados

TABLA No.1

Distribución de Grupos Experimentales

Ensayo Grupo Concentración

403

Macho 1 parte deltametrina: 1 parte de diesel

Hembra 1 parte deltametrina: 1 parte de diesel

412

Alta 3 partes de deltametrina: 65 partes

del diesel

Media 1 partes de deltametrina: 65 partes

del diesel

Baja 0.5 partes de deltametrina: 65 partes

del diesel

Control 1 partes de deltametrina: 65 partes de

aceite mineral

Fuente: Fodecyt 21-2010

GRÁFICA No. 1

Comportamiento del peso según sexo durante Ensayo 403

Fuente: Fodecyt 21-2010

30

TABLA No. 2

Efectos predominantes de la Toxicidad Inhalatoria No. 403

Grupo Observaciones

Machos

Respiración anormal, agotamiento, ligera salivación, letargia, pelaje

erizado del dorso, hiperventilación, lesiones oculares. Al día 7 lesiones

en piel, caída de pelo. Al día 13 un sujeto presenta incapacidad para

caminar con un deterioro evidente.

Hembras Descoordinación de los movimientos, salivación, respiración anormal,

letargia, ojos con edema, poca movilidad.

Fuente: Fodecyt 21-2010

Fotografía No. 1

Efectos visibles de exposición en Ensayo 403

Fuente: Fodecyt 21-2010

31

TABLA No. 3

Efectos predominantes histológicos del Ensayo No. 403

HÍGADO RIÑÓN PULMÓN

degeneración hialina dentro de

hepatocitos, degeneración hidrópica y

áreas focales de esteatosis con ruptura de

paredes celulares, formando cavidades,

perivasculitis con infiltración

mononuclear, área hemorrágica

degeneración tubular en

zona cortical, zona de

esteatosis

áreas atelectásicas,

infiltración

mononuclear, enfisema,

áreas pequeñas de

hemorragia

Degeneración hidrópica a nivel tubular,

dilatación del penacho glomerular,

hialinización. Hiperplasia de células de

conductos biliares (colangitis). Focos de

hemorragia

degeneración hidrópica,

cariomegalia, congestión,

dilatación de penacho

glomerular, hialinización

enfisema severo, leve

edema, en algunas áreas

hay hiperplasia de pared

alveolar

infiltración grasa, esteatosis

algunos túbulos con

degeneración hidrópica, leve

hialinización

enfisema

Fuente: Fodecyt 21-2010

GRÁFICA No. 2

Comportamiento del peso según sexo durante Ensayo 412

Fuente: Fodecyt 21-2010

32

TABLA No. 4

Efectos predominantes de la Toxicidad Inhalatoria No. 412

Grupo Observaciones

Media

Irritación ocular. Al día 11 respiración irregular, agrupamiento,

patas lastimadas. Al día 23 hiperactivos, lesiones en orejas,

ojos, piel y cola.

Alta

Problemas de locomoción, sofocación, agrupamiento

inmediato, respiración irregular, nariz y ojos lastimados,

evidente estrés. Día 14 se retira un animal. Hiperactividad,

autolimpieza, caída de pelo, ojos irritados, lesiones en ojos,

patas y cola.

Baja

Curiosidad normal, comportamiento agitado, agrupados, ojos

cerrados, respiración anormal, se alejan del sitio donde sale el

aerosol. Al día 8 con efectos pero no tan marcados, con mayor

movimiento al ingreso, tratan de escaparse, hiperactivos, ojos

lastimados, caída de pelo.

Aceite

Respiración normal al inicio, agrupados, después de 3 días

respiración irregular, no hay caída de pelo, recuperación rápida

fuera de la cámara, al abrir intentan escapar, agotados,

respiración irregular, pelaje húmedo y amarillento al día 14,

hiperactividad, poca caída de pelo al día 22, poco pelaje en la

cabeza día 27.

Fuente: Fodecyt 21-2010

33

TABLA No. 5

Efectos predominantes histológicos del Ensayo No. 412

GRUPO HÍGADO RIÑÓN PULMÓN

MEDIA

algunos hepatocitos con

cariomegalia, infiltración de

mononucleares alrededor

de algunos canalículos

biliares, degeneración

hidrópica, esteatosis, leve

hemorragia

Hialinización,

degeneración hidrópica

de túbulos, degeneración

hidrópica tubular.

enfisema, infiltración de

neutrófilos, hiperplasia

de células de pared

alveolar

ALTA

infiltración grasa,

esteatosis, degeneración

hidrópica, algunos

hepatocitos con

cariomegalia, infiltración de

mononucleares alrededor de

canalículos biliares,

hepatocitos con

cariomegalia

hialinización, dilatación

del penacho glomerular,

algunos penachos

glomerulares en necrosis

leve edema, hiperplasia

de células de la pared

alveolar, enfisema

BAJA

degeneración hidrópica,

degeneración grasa

multifocal, cuerpos hialinos

degeneración hidrópica

tubular, hiperemia,

degeneración grasa

multifocal

Enfisema, inflamación

linfoplasmocitaria,

hiperemia, algunos

eosinófilos.

ACEITE

degeneración hidrópica,

cuerpos hialinos, áreas de

congestión

(tumefacción turbia y

degeneración hidrópica)

Hiperemia, enfisema,

áreas de inflamación

focal, áreas

hemorrágicas.

Fuente: Fodecyt 21-2010

34

Gráfica No.3

Ensayo Cometa: rata expuesta a deltametrina y disolvente aceite mineral

Programa Casp 1.2.2

Fuente: Fodecyt 21-2010

35

Gráfica No.4

Ensayo Cometa: Grupo control

Programa Casp 1.2.2

Fuente: Fodecyt 21-2010

36

Gráfica No. 5

Ensayo Cometa: Grupo Mediano expuesto a deltametrina y disolvente diesel

Programa Casp 1.2.2

Fuente: Fodecyt 21-2010

37

Gráfica No. 6

Ensayo Cometa: Grupo Bajo expuesto a deltametrina y disolvente diesel

Programa Casp 1.2.2

Fuente: Fodecyt 21-2010

38

Gráfica No. 7

Ensayo Cometa: Grupo Alto expuesto a deltametrina y disolvente diesel

Programa Casp 1.2.2

Fuente: Fodecyt 21-2010

39

III.2. Discusión de Resultados

Se evaluó el daño primario al ADN por ensayo cometa, en células sanguíneas de ratas

expuestas al piretroide deltametrina combinado con diesel como disolvente, a través de la

técnica de electroforesis para células individuales, este piretroide es utilizado para el control de

vectores en Guatemala.

El piretroide deltametrina fue el piretroide seleccionado para el estudio, esto debido a

que es el piretroide que se ha utilizado en los últimos 8 años en el control de vectores,

independientemente de las diferentes marcas comerciales utilizadas, el nombre genérico ha sido

deltametrina. (PLAGSALUD)

La etiqueta de estos productos señala las concentraciones a las cuales deben manejarse y

los disolventes recomendados, para el caso de la deltametrina señala que debe utilizarse aceite

mineral como disolvente y que puede utilizarse inclusive agua. Este disolvente fue descartado

debido a que las condiciones el estudio no aplicaba el uso; la literatura indica que se puede

utilizar agua cuando se trabaja en bajas concentraciones siendo utilizado frecuentemente en

áreas abiertas, razón por la que fue seleccionado el aceite mineral como adecuado para el

propósito del plaguicida.

Estudios señalan que se observa la utilización de deltametrina en combinación con diesel como

disolvente, lo cual fue constatado por el equipo de investigación.

Para evaluar la genotoxicidad de este plaguicida en combinación con el diesel, se realizo

los ensayos 403 y 412 de la OECD “Toxicidad Inhalatoria a dosis Repetidas” aguda y

subaguda.

III.2.1 Evaluación de la Toxicidad aguda por inhalación (Datos sobre DL50) (OECD 403,

2009).

Para la determinación de la dosis letal 50, se utilizó el protocolo establecido número

403 de la OECD, mismo que generó datos útiles para la reducción de animales.

Para este ensayo, se utilizaron como especie animal la rata Wistar, hembras nulíparas y machos,

ambos adultos jóvenes. Cumpliendo con un peso promedio con ± 20 de desviación. Ninguno de

los sujetos estudio fue expuesto ni utilizado en otro estudio. Se llevó a cabo un proceso de

aclimatación al equipo por breves espacios de tiempo previo a iniciar el estudio. La temperatura

del salón de bioensayo se mantuvo a una temperatura promedio de 21ºC ±2º C y la humedad

relativa se mantuvo dentro del rango permitido (30 a 70%). La alimentación y el agua fueron ad

libitum y la secuencia de iluminación fue de 12 horas luz/ 12 horas oscuridad.

La dosis utilizada para dicho ensayo indicada en la tabla No. 1 fue basada en la dosis

máxima establecida para deltametrina de diversas casas comerciales y de la literatura oficial,

por lo cual se utilizó esta misma dosis 1:1; la selección de dicho ensayo fue por diversos

propósitos, además de corroborar la DL50 se utilizó para lograr una reducción del número de

animales en el estudio e identificar si existía sensibilidad predominante por sexo (OECD 309,

2009).

40

Posterior al cumplimiento de todos los aspectos en cuanto al animal de experimentación,

se seleccionó el equipo de exposición, basándose una serie de ventajas y desventajas sobre el

uso de equipo entre el de solo nariz versus el de cuerpo completo (OECD 39, 2009). Se

seleccionó el equipo de cuerpo completo, debido a que por la duración del estudio (403 y 412,

con 4 y 6 horas de exposición respectivamente) permitía el movimiento con libertad dentro de

la cámara disminuyendo el estrés.

Los factores que se controlaron dentro del equipo de exposición, fueron el flujo de aire,

el cual se controló a través del flujómetro, este nos permitía un recambio de 5L por minuto,

evitando con esto una sobreexposición por la atmosfera saturada del aerosol. La dispersión de

las partículas se obtuvo por medio del colisionador que lograba dispersar el líquido en

partículas pequeñas (aerosol). La concentración de la muestra fue monitoreada por la diferencia

de peso del papel filtro que se ubicaba en una salida de la cámara.

Los animales fueron expuestos durante 4 horas diarias por 14 días cada grupo,

observándose respuestas clínicas, los efectos principales en ambos sexos se muestran en la

tabla No. 2; siendo evidente la salivación, la alteración de la respiración, el pelo erizado.

Además de la alteración en cuanto a sus movimientos, se observó un daño evidente a la piel de

los sujetos en exposición, que se observaron desde la caída del pelaje, apariciones de heridas en

el dorso, y en todos los animales se observó lesiones de la piel alrededor de los ojos. En el

grupo de ratas macho, el deterioro de los animales fue evidente con el transcurrir de los días, la

observación fue constante razón por la que el estudio culminó el día 13, para evitar un estrés y

sufrimiento de los animales. Estos efectos se observaron en el grupo de las ratas hembra pero en

menor magnitud. Por lo que se concluyó que la rata macho es más sensible que la rata hembra,

por medio de los signos observados.

La relación del peso con el tiempo del desarrollo del estudio se presenta en la gráfica

No.1 observándose que las hembras fueron los animales que mayor peso perdieron,

aproximadamente 150g y los machos un promedio de 75g ambos grupos cambian la tendencia

del comportamiento normal de una rata, misma que se observa con el grupo control, de

aumentar peso conforme pasan las semanas, observando una tendencia significativa en la

pérdida de peso durante la realización de la experimentación.

El ensayo finalizó el día 13, debido a que por razones de estrés y evidente deterioro de

la salud de los animales se suspendió por decisión unánime. Se procedió a realizar la eutanasia

de los animales siguiendo el método de administración de pentobarbital, el cual es un método

validado y aprobado por diferentes entidades en investigación preclínica; este método, permite

una muerte sin estrés y sin dolor para los animales. La necropsia fue realizada a los animales,

realizando una evaluación visual de los órganos principales, de los cuales se destaca lesiones a

simple vista como se observa en la gráfica No. 2. Se realizaron los informes histológicos donde

se observó una alteración en los tejidos celulares en pulmón, hígado y riñón. En el resumen de

los informes histológicos que se presenta en la tabla No. 3, se puede observar que los efectos

predominantes son mayores en el grupo de los machos que las hembras, siendo importante la

presencia de hemorragias tanto en riñón como en pulmón. La mayoría de daños histológicos

corresponden a alteraciones degenerativas que conllevan a muerte celular. Se observó al igual la

disminución de esteatosis; la acumulación de grasa, que esto se observa asociado a la pérdida

de peso en los animales.

41

Por las observaciones de los signos y los informes histopatológicos se concluye que la

rata macho es más sensible que la hembra, a los efectos de la mezcla deltametrina: diesel.

Siendo importante para la reducción del número de animales, para el desarrollo del ensayo 412.

En cuanto al comportamiento de la mezcla utilizada deltametrina: diesel en la

concentración indicada en la tabla No.1 es importante destacar la presencia de formación de

precipitado, los cuales provocaban taponamiento en los agujeros del colisionador, mismo que

era necesario limpiarlo periódicamente durante las cuatro horas de exposición. Esto es

importante debido a que a esas concentraciones, y si extrapolamos el uso, a una bomba de

aspersión utilizada para fumigar hogares, este tipo de mezcla reduciría la vida útil de las

bombas, provocando un gasto adicional sumado a los posibles problemas que pueden derivar

del uso de esta mezcla a esa dosis.

Fotografía. No.2. Equipo de exposición inhalatoria. CH Technologies Inc.

Fuente: Fodecyt 21-2010

III.2.2 Ensayo 412 Toxicidad sub aguda por inhalación 28 días de estudio

Luego de realizar el ensayo 403 de toxicidad inhalatoria de la OECD, y estimar que los

machos fueron el grupo más sensible a la exposición, se seleccionaron los primeros cinco

animales machos para el ensayo 412, así como los animales para el grupo control.

Para el estudio se sugieren la selección de 3 concentraciones diferentes y un grupo con

disolvente distinto además del grupo control.

Para cada grupo se seleccionaron cinco animales machos, adultos saludables entre 8 y 9

semanas de edad, cuyos pesos no variaran en un ± 20% entre ellos mismos, se colocaron en el

equipo de exposición durante 4 días para lograr su aclimatación a un nuevo ambiente.

El biocontenedor donde fueron colocados los animales fue diseñado por

CHtechnologies Inc., los cuales son expertos en fabricación de equipos de evaluación

toxicológica, el biocontenedor funciona con un flujo de 5 litros por minuto, para asegurar 10

cambios de volumen en una hora y el colisionador proporciona una humedad relativa de 50 a

60%. Ver figura No.1.

42

La técnica empleada fue una exposición de cuerpo completo, la cual es utilizada para

evaluar signos y toxicidad en piel y ojos, que no pueden observarse bajo técnicas de solo nariz

(nose only) (OECD 39, 2009), como se expuso anteriormente.

Concentración alta:

Para el ensayo se preparó una mezcla de deltametrina y diesel en una concentración de

3:65 y se colocó en el colisionador del equipo de exposición. Se expuso a los animales durante

6 horas diarias por 28 días, durante los cuales se monitoreo su comportamiento. (OECD 412,

2009)

Bajo el método de exposición a cuerpo completo se observo que las cinco ratas macho,

presentaron problemas de locomoción, evidentes signos de sofocación y respiración irregular,

se observaron ojos y nariz lastimados. En el día 14 un animal es retirado del estudio por

observarse signos de dolor, todos los animales presentaron pérdida de pelo e irritación en piel,

ojos, patas y cola. Ver tabla No 4.

Todo lo anterior muestra una evidente toxicidad al plaguicida y el diesel a la

concentración elevada con la que se evaluaron, la pérdida de peso fue homogénea para los 4

animales que concluyeron el estudio, y fue similar a la del grupo de concentración normal y

diesel que también perdieron peso. Al comparar el grupo control se observó que este grupo

por el contrario ganó peso durante los 28 días que fueron monitoreados. Ver Gráfica No. 3

3 ratas expuestas fueron sacrificadas luego del ensayo cometa, y fueron enviadas a

patología para un informe histopatológico, y una rata fue dejada viva para grupo satélite y fue

evaluada 14 días después no mostrando ninguna mejoría por lo que fue sacrificada 28 días

después, mostrando un informe histopatológico similar al resto del grupo.

Efectos en Hígado, Riñón y Pulmón

A dosis alta de deltametrina con diesel las ratas sacrificadas presentaron en su informe

histopatológico inflamación de hígado y riñón, destacando también un edema en los pulmones

y enfisema e hiperplasia de las células de la pared alveolar, ver tabla No. 5.

A esta concentración no es posible distinguir si los efectos fueron causados por el

plaguicida o por el diesel, pero la combinación de ambos a esta concentración refleja una seria

toxicidad aguda para mucosas y órganos.

Concentración Media

Fue colocado en el colisionador del equipo una concentración media de deltametrina y

diesel 1:65, esta concentración es la sugerida por el fabricante, el fabricante también sugiere

utilizar solventes como el aceite mineral, sin embargo el objeto del estudio fue evaluar el

disolvente que es actualmente utilizado en Guatemala, el diesel. Ver tabla No.4

Los cinco animales fueron expuestos y observados durante los 28 días de exposición,

encontrando irritación en ojos de los cinco animales, adicionalmente lesiones en piel, cola y

orejas. Las lesiones no diferían de la concentración alta, la caída de pelo fue evidente desde el

tercer día de exposición, una diferencia con la exposición a alta concentración fue que en

43

concentración media todos los animales terminaron el ensayo. La pérdida de peso fue evidente

al terminar el ensayo, comparado con el grupo control que ganó peso, comparativamente el

peso perdido por el grupo a concentración media fue muy similar del grupo que fue expuesto a

concentración alta. Ver tabla No.4

Efectos en Hígado, Riñón y Pulmón

Los cinco animales presentaron en hígado una leve hemorragia e inflamación en hígado

y riñón, además de enfisema pulmonar e hiperplasia, evidenciando un aumento de tamaño en

los tejidos, y consecuentemente una toxicidad aguda a la exposición a la concentración

expuesta.

La toxicidad se relaciona con la combinación del piretroide con el diesel, puesto que no

es posible asegurar que a esta concentración la toxicidad se deba al solvente o al piretroide.

Una rata fue dejada sin sacrificar y evaluada luego de 14 días, donde se observo caída

de pelo, no mostro aumento de peso ni mejora de los daños en ojos, nariz y orejas, luego se

observo una progresiva mejoría de las patas y cola así como la piel. Ver tabla No.5

Concentración Baja

La concentración más baja fue de 0.5:65 deltametrina: diesel, a esta concentración se

observaron ligeras diferencias respecto a los grupos con concentración alta y media, en cuanto

al peso esta bajo ligeramente manteniéndose prácticamente igual, sin embargo el grupo control

subió de peso. La diferencia respecto a los grupos expuestos a concentración alta y media fue

que estos bajaron de peso significativamente. Ver tabla No. 4

Los animales mostraron respiración irregular al igual que los demás grupos, sin

embargo esta no fue al tercer día sino al octavo día en adelante, también mostraron ojos

lastimados y caída de pelo.

Efectos en Hígado, Riñón y Pulmón

Los efectos observados en el informe histopatológico reflejan enfisema pulmonar, e

inflamación linfoplasmocitaria, también se encontró hiperemia debido a una sobre estimulación

de los órganos y respiración anormal que ocasionó falta de oxigeno en el órgano, sin embargo

no mostró una inflamación similar a los órganos de los animales expuestos a concentraciones

elevadas y media de deltametrina. Ver tabla No.5

Concentración Media: aceite mineral

Para comparar la toxicidad inhalatoria aguda del diesel, se realizo un cuarto grupo a

dosis repetidas, en esta concentración se utilizó la indicada por el fabricante 1:65 para esta se

utilizó deltametrina y aceite mineral como sustitución al diesel. Ver tabla No. 4

En la Gráfica No. 3 se observa el aumento de peso de los cinco animales utilizados, lo

que demuestra una diferencia significativa respecto a los otros grupos.

44

En la tabla No. 3 se detallan las observaciones de cada grupo, donde para el grupo

donde se utilizo aceite mineral se muestran que al igual que en la concentración baja, los signos

se observaron a partir del tercer día sin embargo estos fueron en gran medida mucho menos

evidentes, los ojos también se mostraron lastimados y caída de pelo en poca cantidad. La

respiración de los animales fue una diferencia significativa puesto que la respiración fue

irregular pero en menor medida a los otros grupos, la cola, piel y patas no mostraron daño

semejante a los otros grupos.

Efectos en Hígado, Riñón y Pulmón

El informe histopatológico evidenció áreas de congestión en el hígado, inflamación del

riñón y pulmones, así como enfisema en pulmón. Ver tabla No.5

Los efectos de este grupo fueron tóxicos al igual que en lo grupos con diesel a diferentes

concentraciones, sin embargo hubo diferencias muy significativas, que pudieron ser observadas

por el método de exposición a cuerpo completo, el peso fue el más sobresaliente conjuntamente

con los efectos observados durante los 28 días.

Una rata fue dejada sin sacrificar y se observó una recuperación en pelo y ojos.

III.2.3. Electroforesis en células individuales, Ensayo cometa.

La genotoxicidad es el resultado dañino de la interacción de agentes químicos o físicos

con el material genético, manifestándose a través de alteraciones y/o cambios en el material

genético del individuo, que además pueden incorporarse en generaciones celulares subsecuentes

conocidas como mutaciones. La determinación genotóxico de contaminantes ambientales o de

compuestos naturales con fines terapéuticos, resultan una herramienta útil para la identificación

de riesgos (Curtis, 2009).

Existen una gran variedad de bioensayos útiles para evaluar genotoxicidad, entre ellos

se encuentra la electroforesis unicelular en gel, llamado comúnmente ensayo cometa, el cual en

este caso fue a través de un método microscópico fluorescente rápido y sensible, que permitió

examinar el daño al ADN en células de forma individual, analizándose 50 células para cada

caso. El fundamento de este ensayo para detectar daños al ADN producidos por un

rompimiento simple o doble en la cadena, daño exudativo inducido y entrecruzamiento de

ADN-ADN/ADN-proteína, se basa en la fragilidad que poseen los sitios dañados; al ser

sometidos a un pH superior a trece y su comportamiento en una electroforesis. Los fragmentos

de ADN, producto de la acción de la sustancia a probar, afectados por el pH alcalino, migran a

una velocidad diferente del resto del material nuclear formando la cola del “cometa”, entre más

larga sea esta porción mayor es el daño ocasionado al ADN (Curtis, 2009).

La toma de muestra sanguínea para el ensayo cometa se realizó un día posterior al día

28, obteniéndose un volumen de 0.5mL por cada espécimen mediante la extracción de sangre

en la cola. Se realizó el ensayo cometa por triplicado para cada individuo. Sirviendo de base el

protocolo establecido para electroforesis en gel unicelular desarrollado por Singh. Utilizando

las células sanguíneas en agarosa y realizando una electroforesis en condiciones alcalinas (pH

45

mayor a 13), seguido de la cuantificación individual de 50 células para cada individuo bajo un

microscopio con campo de fluorescencia, utilizando bromuro de etidio (Dhawan, 2006).

El daño al ADN fue realizado por la fijación del ADN con el bromuro de etidio usando

un objetivo de 40x. Se realizó un registro fotográfico de los individuos para ser analizados a

través del software CASP el cual permite la evaluación cuantitativa del daño al ADN, medido a

través del largo de la migración del ADN y el porcentaje de migración del ADN, además del

porcentaje de ADN presente en la cabeza del cometa.

Fotografía .3. Electroforesis en gel de células individuales

Fuente: Fodecyt 21-2010

Los individuos del ensayo 412 fueron sometidos a evaluación del daño de ADN por

ensayo cometa, de acuerdo a los datos obtenidos por el grupo expuesto a deltametrina y aceite

mineral en la concentración recomendada por la literatura (1 parte de deltametrina por 65 de

disolvente), el resultado promedio del largo de la cabeza del cometa fue de 117 el largo de la

cola fue de 3, mientras que el largo total del cometa fue de 120. Obteniéndose un porcentaje de

ADN en la cabeza de 99% y en la cola un 1%, observándose en el microscopio células casi

normales, ver la gráfica No. 4. Con estos datos se infiere que no existe daño significativo al

ADN en células sanguíneas en ratas expuestas a deltametrina disuelto en aceite mineral. Esto se

anuda a la evidencia registrada con los signos manifestados por el ensayo de toxicidad

inhalatoria y los hallazgos histopatológicos.

Por lo anterior, se indica que la mezcla deltametrina/aceite mineral es una forma adecuada

de poder trabajar con el plaguicida, presentando un grado bajo de riesgo a la salud.

46

Fotografía. 4. Extracción de sangre periférica

Fuente: Fodecyt 21-2010

De los individuos seleccionados como el grupo control, el resultado promedio del largo

de la cabeza del cometa fue de 167, el largo de la cola fue de 27, mientras que el largo total del

cometa fue de 194. Obteniéndose un porcentaje de ADN en la cabeza de 94% y en la cola un

6%, observándose en el microscopio células normales, sin aparente daño, ver gráfica No. 5.

Con estos datos se infiere que no existe daño significativo al ADN en células sanguíneas en

ratas control, las cuales estuvieron en las mismas condiciones que los grupos experimentales.

Esto se anuda a la evidencia registrada con los signos manifestados por el ensayo de toxicidad

inhalatoria y los hallazgos histopatológicos, los cuales manifestaron pocas alteraciones en los

órganos principales. Por lo anterior, se verifica que las condiciones tanto del bioterio como las

condiciones en que se realizó el ensayo cometa son satisfactorias; evidenciando con estos

resultados que la técnica utilizada para el ensayo cometa, tanto la solución de lisis como la

electroforesis fueron aceptables debido a que no generaron mayor daño por la lisis efectuada.

Los individuos que fueron evaluados con el ensayo 412 con diesel, fueron sometidos a

evaluación del daño de ADN por ensayo cometa, de acuerdo a los datos obtenidos por el grupo

expuesto a deltametrina y diesel a la concentración recomendada por la literatura (1 parte de

deltametrina por 65 partes de diesel), el resultado promedio del largo de la cabeza del cometa

fue de 61, el largo de la cola fue de 49, mientras que el largo total del cometa fue de 110.

Obteniéndose un porcentaje de ADN en la cabeza de 45% y en la cola un 55%, observándose

en el microscopio células con un daño. Con estos datos se infiere que existe un daño

significativo al ADN en células sanguíneas en ratas expuestas a deltametrina disuelto en diesel.

Esto se anuda a la evidencia registrada con los signos manifestados por el ensayo de

toxicidad inhalatoria y los diversos hallazgos histopatológicos, que evidencian el daño que

ocasiona el uso de estos compuestos, tanto en piel como a los órganos principales. Por lo

anterior, se indica que la utilización de la mezcla deltametrina/diesel a dosis mediana (1 parte

de deltametrina: 65 parte de diesel) representa un riesgo alto a la salud.

47

De los grupos que fueron evaluados con el ensayo 412 con diesel, fueron sometidos a

evaluación del daño de ADN por ensayo cometa, de acuerdo a los datos obtenidos por el grupo

expuesto a deltametrina y diesel a una concentración baja (0.5 parte de deltametrina por 65

partes de diesel), el resultado promedio del largo de la cabeza del cometa fue de 109, el largo de

la cola fue de 48, mientras que el largo total del cometa fue de 157. Obteniéndose un porcentaje

de ADN en la cabeza de 77% y en la cola un 23%, observándose en el microscopio células con

un daño. Con estos datos y anudado a la evidencia registrada con los signos manifestados por el

ensayo de toxicidad inhalatoria y los diversos hallazgos histopatológicos, que evidencian el

daño que ocasiona el uso de estos compuestos, tanto en piel como a los órganos principales, se

infiere que existe un daño significativo al ADN en células sanguíneas en ratas expuestas a

deltametrina disuelto en diesel. Por lo anterior, se indica que la utilización de la mezcla

deltametrina/diesel a dosis baja (1 parte de deltametrina: 65 parte de diesel) representa un

riesgo a la salud.

El último grupo que fue evaluado con el ensayo 412 con diesel, fue sometido a

evaluación del daño de ADN por ensayo cometa, de acuerdo a los datos obtenidos por este

grupo expuesto a deltametrina y diesel a una concentración alta (3 partes de deltametrina por 65

partes de diesel), el resultado promedio del largo de la cabeza del cometa fue de 177, el largo de

la cola fue de 254, mientras que el largo total del cometa fue de 431. Obteniéndose un

porcentaje de ADN en la cabeza de 48% y en la cola un 52%, observándose en el microscopio

células con un evidente daño. Con estos datos se infiere que existe un daño significativo al

ADN en células sanguíneas en ratas expuestas a deltametrina disuelto en diesel. A esto se añade

la evidencia registrada con los signos manifestados por el ensayo de toxicidad inhalatoria y los

informes histopatológicos, en los cuales se observaron signos de daño y alteraciones en los

tejidos al ser analizados en él microscopio. Por lo anterior, se indica que la utilización de la

mezcla deltametrina/diesel a dosis alta (3 partes de deltametrina: 65 parte de diesel) representa

un riesgo grave a la salud.

El propósito del plaguicida puede alcanzarse según datos experimentales del fabricante

con una concentración de 1:65 sin embargo el solvente ideal para este debe ser una alternativa

al actualmente utilizado en Guatemala, como lo puede ser el aceite mineral, el agua puede ser

otra alternativa sin embargo la concentración sugerida con agua como disolvente resultaría ser

inadecuadamente baja para el propósito del plaguicida.

48

Fotografía. 5. Microscopio de campo oscuro del Departamento de Citohistología

Fuente: Fodecyt 21-2010

49

PARTE IV

IV.1 Conclusiones

IV.1.1. Se determinó que existe un daño significativo al ADN en las células sanguíneas de

ratas expuestas a deltametrina con diesel, presentando un aumento del daño al

incrementar la concentración de deltametrina en la solución. Se observó un mayor daño

al ADN cuando se empleo diesel como disolvente a diferencia del aceite mineral.

IV.1.2. La dosis letal 50 fue reemplaza por el ensayo de exposición aguda, donde se estableció

que la concentración del plaguicida y disolvente fue en una relación 1:1, además en este

ensayo se evidenció que los machos fueron los sujetos más sensibles ante la exposición

inhalatoria del plaguicida con el disolvente.

IV.1.3. Se observaron signos y evidencias histológicas del daño ocasionado por la exposición

de las ratas macho al ser sometidas al ensayo de toxicidad inhalatoria, existiendo un

daño significativo cuando fueron expuestas al disolvente diesel. Con el aceite mineral

presentaron daños menores al ser sometidas al mismo ensayo.

IV.1.4. Se determinó que existe un daño primario al ADN significativo en las células

sanguíneas de las ratas expuestas a deltametrina con diesel como disolvente.

IV.1.5. El grupo expuesto a la solución de deltametrina y aceite mineral (1:65) presentó un

grado bajo de daño al ADN, mientras que los individuos sometidos a la solución de

deltametrina y diesel (1:65) presentaron un grado alto de daño primario al ADN. El

daño primario al ADN en las células es directamente proporcional con la

concentración de deltametrina disuelta en diesel.

IV.1.6. La utilización de deltametrina con el aceite mineral, como disolvente, no presentó

daños a las células individuales, es decir, que la utilización de esta mezcla , es la

idónea ya que no se evidenció riesgo de dañar al ADN; sin embargo, la exposición

continua a esta sustancia se observaron lesiones en hígado, riñones y pulmones.

IV.1.7 .El piretroide utilizado, deltametrina, combinado con el disolvente recomendado por la

casa fabricante, siendo el aceite mineral; posee una toxicidad inhalatoria subaguda

significativamente menor que con el disolvente diesel.

IV.1.8. El propósito del plaguicida puede alcanzarse según datos experimentales del fabricante

con una concentración de 1:65 sin embargo el solvente ideal para este debe ser una

alternativa al actualmente utilizado en Guatemala, como lo puede ser el aceite mineral,

el agua puede ser otra alternativa sin embargo la concentración sugerida con agua como

disolvente resultaría ser inadecuadamente baja para alcanzar la concentración del

plaguicida y que este logre su propósito.

50

IV.2. Recomendaciones

IV.2.1. Utilizar el ensayo cometa para evaluar el daño primario en ADN en poblaciones

humanas expuestas a piretroides, con el fin de establecer un panorama de riesgo de la

población guatemalteca.

IV.2.2. Reemplazar los ensayos de dosis letal 50 en estudios experimentales, por ensayos

específicos que pueden proporcionar mayor información y no solo la determinación de

la dosis.

IV.2.3. Recomendar la utilización de otro vehículo (disolvente) para la dispersión de los

plaguicidas con el fin de minimizar el riesgo de daño al ADN en la población

guatemalteca.

IV.2.4. Divulgar los resultados a las instituciones de interés, tanto científico como social, que

la utilización del diesel como disolvente o vehículo de la deltametrina, conlleva a un

mayor riesgo que el beneficio en el control de vectores.

IV.2.5. El grupo expuesto a la solución de deltametrina y aceite mineral (1:65) presentó un

grado bajo de daño al ADN, mientras que los individuos sometidos a la solución de

deltametrina y diesel (1:65) presentaron un grado alto de daño primario al ADN. El

daño primario al ADN en las células es directamente proporcional con la

concentración de deltametrina disuelta en diesel.

IV.2.6. Reemplazar la utilización de la deltametrina por un control de vectores orgánico,

debido que independientemente del disolvente; este siempre conlleva a un riesgo en su

utilización, sobretodo sino se utiliza a la concentración recomendada, no utilizando el

equipo adecuado y las recomendaciones proporcionadas por el fabricante.

IV.2.7. La exposición a piretroides conlleva un riesgo amplio por el uso inadecuado, razón por

la cual deben de divulgarse los resultados de este estudio, realizar estudios

poblacionales, concientizar a los trabajadores de las instancias de salud y educar a la

población en cumplir con las medidas de seguridad para evitar una exposición ante

sustancias químicas, que desencadenan problemas en salud a largo plazo.

51

IV.3. Referencias Bibliográficas

Arencibia D, Rosario L. Actualización sobre el ensayo cometa y de micronúcleos in vitro.

2003. Revista de Toxicología en Línea. Sertox. Cuba. Pp. 24-41.

Brozovic G, et. Al. DNA damage and repair after exposure to sevoflurane in vivo, evaluated

in Swiss albino mice by the alkaline comet assay and micronucleus test. 2010. J. Appl

Genet 51 (1). Pp 79-86.

Crespo, R; M, Ricard; García de Bravo M y Güerci A. Optimización del ensayo cometa

mediante la utilización de microgeles únicos. Tercera Época. Revista Cientifica de la

Facultad de Ciencias Médicas. 2011. Octubre, 2(3): 1-1

Curtis D. (Ed.) Casarett & Doull´s Toxicology. The basis science of Poisons. The McGraw-

Hill Companies, Inc. 7ª Ed. United States.2008. Chapters 12 and 23.

DeMarini David M. y Huff James. Enciclopedia de Salud y Seguridad en el Trabajo.

Capítulo33. Toxicología. Instituto de Salud e Higiene en el Trabajo. España. 2001. Pp.

49.

Dhawan A., Bajpayee M., Parmar D.Comet assay: a reliable tool for the assessment of

DNA damage in different models. 2008. Cell Biol Toxicol. Feb; 25(1):5-32.

Emara AM, Draz El. Immunotoxicological study of one of the most common over-the-

counter pyrethroid insecticide products in Egypt. 2007. Inhal Toxicol. Vol. 19 Num. 12.

Pp. 997-1009.

Hayes, W.J. Jr. Toxicology of pesticides. The Williams and Wilkins Company, USA.

Hossain M. et al. Differential effects of pyrethroid insecticides on extracellular dopamine in

the striatum of freely moving rats. 2006. Toxicology and Applied Pharmacology. Vol

217.Num 1. 1995. Pp 25-34.

ILARCLSNRC. Guía para el Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio. Institute of

Laboratory Animal Resources Commission on Life Sciences National Research

Council. Edicion Mexicana auspiciada por la Academia Nacional De Medicina. 1999.

Copyright National Academy Press, Washington, D.C. 1996.

Kilian E. Delport R, Bornman M, De Jager & C. Simultaneus expusore to low

concentrations of dichlorodiphenyltrichloroethane, deltamethrin, nonylphenol and

phytoestrogens has negative effects on the reproductive parameters in male Sprague-

Dawley Rats. 2007. Andrology. Vol. 39 Num 4. Pp 128-135.

Kim KB. Et al. Age, dose, and time-dependency of plasma and tissue distribution of

deltamethrin in immature rats. 2010. Toxicol Sci. Vol.115 Num 2 Pp 354-368.

Leikin & Paloucek. Poisoning and Toxicology Handbook. 2008. CRC Press. United States.

Fourth Edition. Pp. 1331.

Li T. et al. Effects of deltamethrin on neurobehavioral development of offspring of

intoxicated rats.2006. Zhonghua Lao Dong Sheng Zhi Ye Bing Za Zhi. Vol. 24.Num. 6.

Pp 330-332.

Misra R. Rita y Waalkes Michael P. Enciclopedia de Salud y Seguridad en el Trabajo.

Capítulo33. Toxicología. Instituto de Salud e Higiene en el Trabajo. España. 2001. Pp.

27-40.

Morales, D., Gallo, L. Plataforma de proteómica. Curso: Métodos Fisíco-Químicos en

Biotecnología. Instituto de Biotecnología. Universidad Nacional Autónoma de México.

2006. Pp. 56.

52

Moretii M. Applicability of specific noninvasive methods for biomonitoring of occupational

exposure to deltamethrin: preliminary study using an animal model. 1997. Arch Environ

Contam. Toxicol. Vol 33 Num 3. Pp 323-328.

OECD 39.2009. Guidelines for testing of chemical. Head of Publications Service

Organization for Economic Co-operation and Development.

Ortiz M. et al. Environmental Health Assessment of Deltamethrin in a Malarious Area of

Mexico: Environmental Persistence, Toxicokinetics, and Genotoxicity in Exposed

Children. 2005. Environmental Health Perspectives. Vol. 113.Num. 6. Pp. 782-786.

Recio L. and col. Dose-response assessment of four genotoxic chemicals in a combined

mouse and rat micronucleus MN and Comet assay protocol. 2009. The Journal of

Toxicological Sciencies. Vol 35. No.2. Pp. 149-162.

Saravia A. Manual de Ensayos Toxicológicos y Farmacológicos Experimentales. In vivo e in

vitro. 2005. Editorial Universitaria. Colección Libro de Texto Universitario.

Universidad de San Carlos de Guatemala. Guatemala.

Shukla Y, Taneja P. Mutagenic evaluation of deltamethrin using rodent dominant lethal

assay. 2000. Mutat Res. Vol 456. Num 2. Pp.119-127.

Tornero-Vélez R, et al. Evaluation of deltamethrin kinetics and dosimetry in the maturing rat

using a PBPK model. 2010. Toxicol Appl. Pharmacol. Vol 244 Num 2. Pp. 208-217.

Vaca-Marín M, y col. Aplicación intradomiciliar de malatión y deltametrina en bajo volumen

para el control de Anopheles sp. 1991. Salud Pública Mex. Vol. 33. Pp. 482-492.

Valverde M., Rojas E.Environmental and occupational biomonitoring using the Comet

assay.2009. Mutat Res. Jan-Feb;681(1):93-109.

Vargas RJ. Guzmán-Quilo C. Del Valle J. DG Saldaña. Pesticide exposure and risk of acute

lymphoblastic leukemia in children from Quetzaltenango, Guatemalan,

Pharmacologyonline vol 1, 2014

Villarini M. et al.In vitro genotoxic effects of the insecticide deltamethrin in human

peripheral blood leukocytes: DNA damage (comet assay) in relation to the induction of

sister-chromatid exchanges and micronuclei. 1998. Toxicology. Vol.130 Num 2-3. Pp.

129-139.

Watanabe Philip G. Enciclopedia de Salud y Seguridad en el Trabajo. Capítulo33.

Toxicología. Instituto de Salud e Higiene en el Trabajo. España. 2001. Pp.32.

Weiner ML. et al. Comparative functional observational battery study of twelve commercial

pyrethroid insecticides in male rats following acute oral exposure. 2009.

Neurotoxicology. 30. Suppl 1: S1-16.

WHO. Deltamethrin. WHO specifications and evaluations for public health pesticides.

WHO. Generic risk assessment model for indoor and outdoor space spraying of insecticides.

2010. World Health Organization. Switzerland.

WHO. Generic risk assessment model for indoor residual spraying of insecticides. 2010.

World Health Organization. Switzerland.

WHOPES. Report of the Thirteenth WHOPES Working Group Meeting. 2009. World Health

Organization. Switzerland.

Zúñiga, L. Optimizaciones metodológicas del ensayo cometa y su aplicación en la

biomonitorización humana. Universidad Autónoma de Barcelona. 2009. Pp. 243.

53

Parte V

V.1. INFORME FINANCIERO AD-R-0013

Nombre del Proyecto:

Numero del Proyecto: 021-2010

Investigador Principal y/o Responsable del Proyecto: DRA. AMARILIS SARAVIA GÓMEZMonto Autorizado: Q346.643,00 01/02/2011

Plazo en meses 18 meses

Fecha de Inicio y Finalización: 01/02/2011 al 31/07/2012 PRÓRROGA AL 31/12/2012

Menos (-) Mas (+)

1 Servicios no personales

181

Estudios, investigaciones y proyectos de

factibilidad 132.070,00Q 130.955,00Q Q 1.115,00

181

Estudios, investigaciones y proyectos de

factibilidad (Evaluación Externa de Impacto) 8.000,00Q Q 8.000,00

191 Primas y gastos de seguros y fianzas 887,00Q 887,00Q Q -

2 MATERIALES Y SUMINISTROS

212 Alimentos para animales 8.000,00Q 7.889,00Q Q 111,00

214

Productos agroforestales, madera, corcho y

sus manufacturas 360,00Q 260,00Q 100,00Q Q -

233 Prendas de vestir 998,00Q 998,00Q Q -

241 Papel de escritorio 500,00Q 282,15Q Q 217,85

243 Productos de papel o cartón 168,60Q 200,00Q 31,40Q Q -

244 Productos de artes gráficas 1.000,00Q 1.500,00Q Q 2.500,00

261 Elementos y compuestos químicos 40.000,00Q 22.484,56Q 14.578,22Q Q 2.937,22

262 Combustibles y Lubricantes 200,00Q 800,00Q 255,00Q Q 745,00

264 Insecticidas, fumigantes y similares 1.000,00Q 750,00Q 250,00Q Q -

266 Productos medicinales y farmaceúticos 1.000,00Q 979,20Q 20,80Q Q (0,00)

267 Tintes, pinturas y colorantes 1.000,00Q 750,00Q 1.130,00Q Q 620,00

268 Productos plásticos, nylon, vinil y pvc 10.000,00Q 60,00Q 6.303,34Q Q 3.636,66

272 Productos de vidrio 2.000,00Q 1.000,00Q 2.416,56Q 3.416,56Q Q -

283 Productos de metal 5.000,00Q 5.000,00Q 8.950,00Q 8.950,00Q Q -

291 Útiles de oficina 30,00Q 26,26Q Q 3,74

292 Útiles de limpieza y productos sanitarios 2.000,00Q 2.500,00Q 3.213,05Q Q 1.286,95

295

Útiles menores, médico-quirúrgicos y de

laboratorio 2.000,00Q 8.050,72Q 10.048,64Q Q 2,08

298 Accesorios y repuestos en general 1.120,00Q 1.120,00Q Q -

299 Otros materiales y suministros 1.000,00Q 1.000,00Q Q -

3

PROPIEDAD, PLANTA, EQUIPO E

INTANGIBLES

323 Equipo médico-sanitario y de laboratorio 100.000,00Q 499,92Q 4.000,00Q 103.500,08Q Q -

GASTOS DE ADMÓN. (10%) 31.513,00Q 31.513,00Q Q -

346.643,00Q 32.202,28Q 32.202,28Q 325.467,50Q 21.175,50Q -Q

MONTO AUTORIZADO 346.643,00Q Disponibilidad 21.175,50Q

(-) EJECUTADO 325.467,50Q

SUBTOTAL 21.175,50Q

(-) CAJA CHICA

TOTAL POR EJECUTAR 21.175,50Q

Pendiente de

Ejecutar Ejecutado

FICHA DE EJECUCIÓN PRESUPUESTARIA

LINEA:

FODECYT

"Evaluación de daño primario al ADN, por ensayo cometa en células sanguíneas de ratas

expuestas a piretroides con diesel como disolvente, que se utilizan para control de vectores

en Guatemala"

Orden de Inicio (y/o Fecha primer pago):

Grupo Renglon Nombre del Gasto Asignacion

Presupuestaria

TRANSFERENCIA

40