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I ANÁLISIS DE ALCALOIDES E ISOTIOCIANATOS EN Raphanus sativus Y CULTIVO IN VITRO DE LA HIERBA DEL SAPO

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extraccion de raphanus sativus, con solventes organicos.

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I

ANÁLISIS DE ALCALOIDES E ISOTIOCIANATOS EN Raphanus sativus Y

CULTIVO IN VITRO DE LA HIERBA DEL SAPO

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II

DEDICATORIAS

A mis padres Mayra y Juan por brindarme la confianza y el apoyo para continuar

con mi meta trazada, por estar siempre a mi lado, por las palabras de aliento en los

momentos más adversos y por ser los mejores padres.

A mi tío José Manuel por todo el apoyo que me ha brindado y saber darme consejos

cuando los he necesitado para poder continuar con mi meta, muchas gracias.

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III

AGRADECIMIENTOS

Dr. en C. Hebert Jair Barrales Cureño le gradezco el apoyo incondicional, la

paciencia que me brindó, la enseñanza y sobre todo por el haberme aceptado como

su alumna para la realización de éste trabajo.

A la Universidad Politécnica del Valle de Toluca, mi casa de estudios por permitirme

llevar a cabo en las instalaciones la realización del presente proyecto.

A mi asesor el Dr. Salvador Chávez Salinas por la orientación para llevar a cabo

éste proyecto.

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IV

ÍNDICE

ANÁLISIS DE ALCALOIDES E ISOTIOCIANATOS EN RAPHANUS SATIVUS Y CULTIVO IN

VITRO DE LA HIERBA DEL SAPO I

DEDICATORIAS II

AGRADECIMIENTOS III

ÍNDICE IV

RESUMEN 1

OBJETIVOS 4

CARACTERIZACIÓN DEL ÁREA EN QUE PARTICIPÓ 5

PROBLEMAS RESUELTOS 7

ALCANCES Y LIMITACIONES 8

DESCRIPCIÓN DE LAS ACTIVIDADES REALIZADAS 25

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 33

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 34

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1

RESUMEN

Dávila Becerril Jenny

ANÁLISIS DE ALCALOIDES E ISOTIOCIANATOS EN Raphanus sativus Y

CULTIVO in vitro DE LA HIERBA DEL SAPO

(Bajo la dirección del Dr. en C. Hebert Jair Barrales Cureño y el Dr. en C. Salvador

Chávez Salinas).

En el presente proyecto se llevó a cabo la extracción de alcaloides e isotiocianatos

del fruto de Raphanus sativus con solventes orgánicos (etanol, metanol y

cloroformo), los cuales se sometieron a vaporización. Los isotiocianatos son

compuestos que exhiben sus propiedades anticarcinogénicas. Los mecánicos de

efectos citotóxicos y citostáticos incluyen la inducción de apoptosis, inhibición de la

progresión del ciclo celular e inhibición de la anglogénesis y se encuentran entre los

agentes quimiopreventivos más efectivos conocidos. Los alcaloides incluyen

alrededor de 12000 compuestos, algunos de estos compuestos se emplean para el

tratamiento de la leucemia, como agentes antihipertensivos contra las arritmias

cardiacas y el mejoramiento de la circulación cerebral.

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INTRODUCCIÓN

El rábano (Raphanus sativus) es un vegetal crucífero al cual se le han atribuido un

gran número de propiedades terapéuticas y farmacológicas a través del uso de la

medicina herbolaria tradicional para el tratamiento de diversas enfermedades en el

ser humano. La planta de R. sativus ha sido utilizado en la medicina tradicional para

el tratamiento de enfermedades del hígado, cálculos renales, cálculos vesiculares y

enfermedades respiratorias. La actividad antibiótica de sus extractos valida su

eficacia contra enfermedades microbianas.

Sus extractos se han usado contra enfermedades gastrointestinales, tratamientos

preventivos contra el colesterol y para bajar los niveles de lípidos en el organismo.

Se ha encontrado un efecto inhibitorio significativo con un extracto de hexano de R.

Sativus en líneas celulares de cáncer humano. (Sutan Beevi 2010).

Tomando en cuenta la alta presencia de sustancias bioactivas en R. sativus se llevó

a cabo la extracción de isotiocianatos y alcaloides a partir de éste fruto, por medio

de solventes orgánicos (metanol. etanol y cloroformo) mediante procesos

fitoquímicos.

La importancia de los isotiocianatos deriva en que son compuestos que exhiben sus

propiedades anticarcinogénica, induciendo la apoptosis de las células cancerígena,

así como en la inhibicion de la progresión del ciclo celular e inhibición de la

anglogénesis, Los alcaloides son uno de los grupos más diversos de metabolitos

secundarios, han sido aislados tradicionalmente de las plantas, de las cuales

alrededor del 20% los contienen. Una gran cantidad de alcaloides se han empleado

en la medicina y muchos de ellos son prominentes fármacos actualmente.

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3

JUSTIFICACIÓN DEL PROYECTO

Los compuestos extraídos fueron los isotiocianatos y alcaloides, a los cuales se les

atribuyen diversas actividades biológicas como antibióticas, antifúngicas,

hipotensivas, y antitumorales, principalmente.

El análisis y caracterización de estos compuestos permite ampliar la posibilidad de

desarrollar fármacos contra diversas enfermedades, así como sustentar de manera

científica las propiedades de los extractos usados en la medicina tradicional.

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OBJETIVOS

Objetivo General:

Analizar cualitativamente el contenido de alcaloides e isotiocianatos en Raphanus

sativus.

Objetivo específico:

Realizar un método fitoquímico respecto a la extracción de alcaloides e

isotiocianatos de los extractos de Raphanus sativus.

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CARACTERIZACIÓN DEL ÁREA EN QUE PARTICIPÓ

El presente proyecto se llevó a cabo en el Laboratorio de Química de la Universidad

Politécnica del Valle de Toluca, ubicado en el municipio de Almoloya de Juárez en

el Estado de México.

Colecta de especies de Raphanus sativus

La colecta de las especies de Raphanus sativus se llevó a cabo en el municipio de

Jiquipilco, en el Estado de México en el estado maduro del fruto, las muestras se

extrajeron con palas, se lavaron, secaron, se identificaron con la fecha de colecta y

se almacenaron a 0° C para evitar alteraciones por microorganismos.(Kadder 993)

Preparación de los extractos

Se llevó a cabo la extracción clorofórmica, etanólica y metanólica de los alcaloides

e isotiocianatos de R. sativus mediante el siguiente proceso fitoquímico:

Extracción clorofórmica, etanólica y metanólica: Se utilizaron tres ejemplares de

rábano negro (Raphanus sativus L. var. niger).Se extrajo la corteza del fruto con

cortes semifinos. La corteza extraída se recolectó en un vaso de precipitados de

500 mL, previamente lavado y esterilizado. Se pesaron 30 matraces Erlenmeyer de

20 mL en una balanza analítica y se agregaron 2 g de corteza de R. sativus a cada

matraz. A 10 repeticiones se adicionaron 20 mL de cloroformo, a 10 se adicionaron

50 mL de etanol y a las 10 últimas repeticiones se adicionaron 20 mL de metanol,

los matraces se cubrieron con un tapón de aluminio y se etiquetaron.

Posteriormente, con un bisturí se realizaron cortes semifinos del fruto de R. sativus

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en fragmentos de 0.5 cm y se colectaron en un vaso de precipitados de 50 mL,

posteriormente se pesaron 30 matraces Erlenmeyer de 20 mL y se agregaron 2 g

de las hojuelas del fruto. A 10 muestras adicionaron 20 mL de cloroformo, a 10 se

adicionaron 50 mL de etanol y a las 10 restantes se adicionaron 20 mL de metanol.

Finalmente se cubrieron con un tapón de aluminio y se etiquetaron.

Filtración y evaporación de extractos

Las muestras de R. sativus, que se obtuvieron mediante la extracción clorofórmica,

etanólica y metanólica, se filtraron por gravedad con un embudo cónico y papel filtro

para eliminar los sólidos. La suspensión de cada matraz se colectó en tubos de

ensayo de vidrio con tapa y se etiquetaron. Posteriormente, se tomaron 10 mL de

cada repetición de las muestras de fruto y de corteza de R. sativus con los distintos

solventes y se depositaron en matraces Erlenmeyer de 25 mL. Cada matraz se

colocó en una placa calefactora para evaporar totalmente el solvente. Finalmente

se adicionó 1 mL del solvente correspondiente a las muestras secas de fruto y de

corteza de R. sativus de cada matraz.

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PROBLEMAS RESUELTOS

Se obtuvieron los alcaloides y los isotiocianatos a partir de los tres distintos tipos de

extracciones.

Los resultados arrojaron que la extracción etanólica fue la más óptima debido a que

al momento de obtener los cristales se obtuvo mayor cantidad de los compuestos

alcaloidales e isotiocianatos.

También se obtuvo mayor presencia de vitamina C en el extracto etanólico de la

corteza de R. sativus debido a que hubo una mayor decoloración de la solución

indicadora en comparación con el extracto etanólico a partir del fruto de R. sativus.

A continuación se presentan los principales metabolitos secundarios presentes en

Raphanus sativus:

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ALCANCES Y LIMITACIONES

Obtención de alcaloides e isotiocianatos

Se obtuvieron los alcaloides y los isotiocianatos a partir del fruto de R. sativus

mediante de solventes orgánicos (cloroformo, metanol y etanol).

Los alcaloides son compuestos de carácter básico, su solubilidad varía en función

del pH, es decir según se encuentre en estado de base o de sal: En forma de base,

son solubles en solventes orgánicos no polares como éter etílico, cloroformo,

diclorometano, y acetato de etilo. En forma de sales son solubles en solventes

polares como agua, soluciones ácidas e hidroalcohólicas. (Arango 2008).

El fundamento de la extracción se basa en el carácter básico de los alcaloides y en

el hecho de su existencia en las plantas como sales ácidos orgánicos o como

combinaciones de otras sustancias.

Las técnicas de reconocimiento para los alcaloides son basadas en la capacidad

que tienen los alcaloides para combinarse con el yodo y metales pesados formando

precipitados.(Arango 2008).

En el presente proyecto se llevó a cabo la extracción con los tres solventes

orgánicos corroborando que son los más aptos para obtener los compuestos

alcaloidales y los isotiocianatos, obteniendo la mayor cantidad a partir de la

extracción etanólica. Respecto al cultivo in vitro de la hierba del sapo no se pudo

llevar a cabo, debido a que la especie no crecía en la temporada en la cual se llevó

a cabo la metodología de la experimentación.

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BASE TEORICO-PRÁCTICAS UTILIZADAS

Características botánicas de Rhapanus sativus

Esta planta pertenece a la familia de las crucíferas, la cual contiene varios vegetales

de importancia económica. Raphanus sativus L. var niger es procedente de Europa

y Asia. Crece en climas templados y a latitudes de entre 190 y 1240 m. La planta

mide entre 30 y 90 cm de alto y sus raíces son de gruesas y de distintos tamaños,

formas y colores. Los frutos son comestibles y presentan sabor picante y las raíces

del rábano tienen un característico color amarillo, que se genera durante el

almacenamiento.

Distribución geográfica

El origen de R. sativus no se conoce con exactitud, pero es usado el tratamiento

de varias enfermedades en varias regiones de Asia y África.

Figura 1. Origen geográfico de R. sativus.( O’Hare,T, 2010 )

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Usos terapéuticos

La planta de R. sativus ha sido utilizado en la medicina tradicional desde hace

muchos años para el tratamiento de enfermedades del hígado, cálculos renales,

cálculos vesiculares y enfermedades respiratorias. La actividad antibiótica de sus

extractos valida su eficacia contra enfermedades microbianas.

Sus extractos también se han usado contra enfermedades gastrointestinales,

tratamientos preventivos contra el colesterol y para bajar los niveles de lípidos en el

organismo.

Diversos autores han encontrado lo siguiente: se ha encontrado un efecto inhibitorio

significativo con un extracto de hexano de R. Sativus en líneas celulares de cáncer

humano. SutanBeevi (2010). El extracto obtenido de R. sativus induce muerte

celular tanto en p53 competente y líneas de células deficientes de p53 mediante

inducción de la apoptosis. Los mecanismos moleculares de R. sativus que indujeron

apoptosis, pueden implicar las interacciones entre los genes de las familias Bcl2 y

regulación de genes anti apoptosis. El análisis del extracto de hexano reveló la

presencia de distintos isotiocianatos como 4-(metiltio)-3-butenilisotiociantato e

isotiocianato-4-pentenil. Sutan Beevi (2010).

El extracto etanólico de R. sativus es un inhibidor del crecimiento celular mediante

la modulación de genes relacionados con la apoptosis celular, de la expresión de

mRNA, así como de los genes ErbB(2) y ErbB(3) en el cáncer de mama. Jan

Muhammad (2012).

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El extracto etanólico de R. sativus disminuyó significativamente la proliferación

celular después de 48 h de incubación (P <0,05). La expresión de la proteína y

ARNm de ErbB y de ErbB se redujo significativamente de una manera dependiente

de la dosis. Jan Muhammad (2012).

Contacto alérgico

El isotiocianato de alilo, se identificó como una posible sustancia sensibilizante. En

algunos casos, puede producir dermatitis y contacto alérgico. Las hojas de esta

planta también contienen glucoparin que produce contacto alérgico.

El jugo crudo de los rábanos inhibió el crecimiento in vitro de Escherichia coli,

Pseudomonas pyocyaneus, Salmonella typhi y Bacillus subtilis. Esta planta común

puede ser una fuente importante de sustancias antimicrobianas. Los péptidos ricos

en cisteína (AFP1-Rs y Rs-AFP2) aislado de R. sativus mostraron gran actividad

antifúngica contra varias especies de hongos con concentración inhibitoria mínima

(CIM) de 30 – 60 μg/ml. Ambos Rs-AFPs están entre las más potentes proteínas

antifúngicas caracterizadas. Por otra parte, su actividad antibiótica muestra un alto

grado de especificidad para hongos filamentosos. La región activa de la proteína

antifúngica parece implicar β-líneas 2 y 3 en combinación con el lazo que conecta

esos filamentos. AFP1-RS y Rs-AFP2 son proteínas oligoméricas altamente básicas

compuestas por pequeñas (5-kDa) polipéptidos ricos en cisteína. Estas proteínas

se encuentran en la pared celular y ocurren predominante en las capas externa de

la célula recubren órganos diferentes semillas. Por otra parte, Rs-AFP preferencial

son liberadas durante la germinación de las semillas después de la interrupción de

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la capa de semilla. Dos proteínas antifúngicas RAP-1 purificaron y RAP-2, aisladas

de semillas de R. sativus exhiben inhibición de actividades contra Candida albicans

y Saccharomyces cerevisiae. La proteína AFP1 aislada del rábano muestra

actividad antifúngica contra Fusarium culmorum.

El ácido cafeico muestra propiedades antifúngicas contra Helminthosporium

maydis. El ácido ferúlico es un antibacteriano activo contra Sytaphylococcus aureus,

Bacillus subtilis, Corynebacterium, difteria, Aspergillus niger y Candida albicans.

Estos ácidos muestran actividad antibacteriana frente a bacterias Gram-positivas

Bacillus subtilis y Staphylococcus aureus y gram-negativos Escherichia coli y

Kliebsiella pneumoniae.

Los ácidos p-hidroxibenzoico (hidroxicinámico, p-hidroxibenzoico) muestran una

marcada actividad contra Bacterias Gram-positivas.

El rábano libera compuestos biocidos, principalmente isotiocianatos, producidos

durante la degradación enzimática de glucosinolatos presentes en la célula vegetal.

La mayor actividad fungicida depende de la concentración de isotiocianatos.

Actividad antitumoral

Una fracción neutral de extracto acuoso de rábano muestra inhibición in vitro de la

proliferación de las células de papovavirus SV40. El diaminotolueno (2, 4-D)

muestra mayor actividad citotóxica contra células HeLa.

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Actividad antiviral

La pelargonidina y el ácido cafeico son virucidas para varios virus envueltos. Los

lipopolisacáridos muestran actividad antiherpético.

Inhibidores del crecimiento

Ácido 2-tioxotiazolidina-4-carboxílicos, es un inhibidor del crecimiento aislado de

extracto acetónico a partir de plántulas expuestas a la luz. Las giberelinas se

identificarón en los extractos de las semillas maduras de rábano.

Hipotensor

La sinapina es un compuesto hipotensor constituyente de la semilla de R. sativus.

Inhibidor de la agregación plaquetaria

El 6-metil-sulfinilhexil-isotiocianato (MS-ITC) se aisló del rábano como un potencial

inhibidor in vitro de la agregación de plaquetas humanas. Es un potencial inductor

de GST (glutación S-transferasa). En el mecanismo de MS el CCI, la molécula de

isotiocianato de MS-ITC desempeña un papel importante para las actividades

antiagregante plaquetarios y anticancerígenos debido a su alta reactividad con

sulfidrilo (-SH) grupos de biomoleculas (GSH, cisteína, residuo en una cierta

proteína).

Fitoalexinas

La inoculación de raíces con la bacteria Pseudomonas cichorii indujo la formación

de varios compuestos antifúngicos incluyendo brassinin, metoxibrassinin,

spirobrassinin y 3-indolecarbaldehidos.

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Principio picante

El trans-4-metiltio-3-butenil-isotiocianato es el compuesto responsable del principio

picante del rábano es extraído de la raíz. El compuesto cis-isomerida es un producto

generado a partir del principio picante del rábano. Este compuesto posee actividad

antimicrobiana contra hongos y bacterias con concentraciones que van desde 50 –

400 μg/ml.

Las acciones antifúngicas y antibacterianas se deben a las actividades bactericidas

y esporicidas.

Prevención de enfermedades cardiovasculares

El polvo del rábano disminuye los niveles de lípidos aumentando la excreción fecal

de lípidos totales, triglicéridos y colesterol total. Los flavonoides y la vitamina C en

rábano pueden inhibir la peroxidación lipídica e inhibir actividades XOD en los

tejidos animales.

Isotiocianatos y alcaloides

Los glucosilonatos son sustancias aromáticas que confieren un sabor picante a las

verduras, sólo cuando se cortan se liberan estos compuestos en estructuras de

isotiocianatos, tiocianatos e indoles, dependiendo de su precursor biosintético ya

sea metionina, fenilalanina, o triptófano.

En específico los isotiocianatos son compuestos que exhiben sus propiedades

anticarcinogénicas por sus habilidades de inducir genes citoprotectivos. Los

mecánicos de efectos citotóxicos y citostáticos de los ITC incluyen la inducción de

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apoptosis, inhibición de la progresión del ciclo celular e inhibición de la

anglogénesis.

Los isotiocianatos están entre los agentes quimiopreventivos más efectivos

conocidos. Una amplia variedad de isotiocianatos previenen el cáncer de diferentes

tejidos incluyendo el de pulmón, glándula mamaria, esófago, hígado, intestino

delgado, colon y vesícula biliar, evidenciado en experimentos con ratas.

Los alcaloides son uno de los grupos de metabolitos secundarios más diversos

encontrados en los vegetales, son casi siempre incoloros, son normalmente sólidos

a temperatura, se pueden encontrar en distintas partes de la planta, ya sea hojas,

fruto, semillas y raíces.

Este grupo incluye alrededor de 12000 compuestos entre los cuales se encuentran

alcaloides indólicos que son los obtenidos a partir de triptófano. Entre los alcaloides

más importantes se tienen a los de tipo bsindólico como la vinblastina empleada en

el tratamiento de la leucemia, además de los alcaloides monoterpen-indólicos como

la almalicina y serpentina utilizados como agentes antihipertensivos contra las

arritmias cardiacas y el mejoramiento de la circulación cerebral.

Biosíntesis de alcaloides e isotiocianatos.

a) Biosíntesis de los isotiocianatos

Cuando se dañan o rompen las células vegetales, la enzima mirosinasa es liberada

y cataliza la hidrólisis de los glucosinolatos formando isotiocianatos. Los

isotiocianatos son responsables, en parte del sabor agudo de ciertos vegetales

crucíferos y de la familia Brassica.

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Los isotiocianatos están entre los agentes quimiopreventivos más efectivos

conocidos. Una amplia variedad de isotiocianatos previenen el cáncer de diferentes

tejidos incluyendo el de pulmón, glándula mamaria, esófago, hígado, intestino

delgado, colon y vesícula biliar, evidenciado en experimentos con ratas.

Existen más de 100 glucosilonatos distintos que son precursores de isotiocianatos

que han sido aislados de plantas que se encuentran en vegetales crucíferos como

el brócoli, repollo, coliflor, nabo, rábano, berro, coles de bruselas y mostaza.

Cuando las verduras crudas son masticadas o maceradas se produce la hidrólisis

por la enzima mirosinasa.

El proceso de hidrólisis ocurre en los glucosilonatos cuando el tejido vegetal se

rompe como consecuencia de una daño mecánico, por lo que la enzima mirosinasa

se pone en contacto con el sustrato y libera moléculas de glucosa, de bisulfato y de

la correspondiente aglucona; posteriormente, esta última experimenta un

acomodamiento.

Los glucosilonatos son compuestos estables localizados en las vacuolas y están

separados de la enzima mirosinasa cuando la planta está intacta, sin embargo los

glucosilonatos se hidrolizan rápidamente cuando se mezcla la mirosinasa que

elimina el azúcar de los glucosilonatos dando como resultado isotiocianatos, nitrilos,

cianuros orgánicos y tiocianato iónico. (Figuras 2 y 3)

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Figura 2. Esquema de la biosíntesis de glucosilonatos e hidrólisis que muestra la

ruta de biosíntesis que conduce a los isotiocianatos.(Loyola-Vargas, 2004)

Figura 3. Degradación de glucosilonatos mediante la enzima mirosinasa que

cataliza la formación de aglicona. (Loyola-Vargas, 2004)

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b) Biosíntesis de los alcaloides

La mayoría de los alcaloides son heterocíclicos aunque algunos son compuestos

nitrogenados alifáticos (no cíclicos) como la mescalina o la colchicina.

A los valores normales de pH del citosol y de la vacuola (7,2 y 5-6, respectivamente),

el nitrógeno está protonado lo cual confiere el carácter básico o alcalino de estos

compuestos en solución.

Se sintetizan normalmente a partir de lisina, tirosina y triptófano, aunque algunos

como la nicotina y compuestos relacionados derivan de la ornitina.

Los aminoácidos son precursores de los alcaloides y sufren una serie de

transformaciones:

Formación de bases de Schiff (genera enlaces C=N)

Figura 4. Formación de base de Schiff. (Loyola-Vargas, 2004)

Condensación Mannich que genera enlaces C-C-N, es una condensación entre un

carbanión, un aldehído o cetona u una amina primaria o secundaria.

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Figura 5. Mecanismo de una condensación de Mannich (Loyola-Vargas, 2004).

Oxidaciones

Reducciones

Condensación aldólica

Figura 6. Mecanismo de formación adólica. (Loyola-Vargas, 2004)

Descarboxilación y deshidratación

Metabolitos secundarios

Definición

Se define metabolismo al conjunto de reacciones químicas que realizan las células

de los seres vivos para sintetizar sustancias que requieren su organismo para su

funcionamiento correcto. Se trata principalmente de aminoácidos, nucleótidos,

azúcares y lípidos y son denominados metabolitos primarios.

En particular, las plantas que son organismos autótrofos poseen un metabolismo

secundario que les permite además de la producción, la acumulación de carbono y

de energía para la síntesis de sustancias que participan indirectamente en los

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procesos de respiración, fotosintéticos y asimilación de nutrientes que son

denominados metabolitos secundarios.

Los metabolitos secundarios no se encuentran en todos los grupos de plantas, se

sintetizan en pequeñas cantidades, tienen funciones específicas como atrayentes,

de protección y de pigmentación.

Tipos de metabolitos secundarios

Las rutas principales de biosíntesis de metabolitos secundarios derivan del

metabolismo primario del carbono, muchos tienen importancia en la industria

cosmética, alimentaria y farmaceútica.

Las principales clasificaciones de los metabolitos secundarios son:

Terpenos: Se encuentran hormonas, pigmentos o aceites esenciales.

Compuestos fenólicos: Cumarinas, flavonoides, lignina y taninos.

Glicósidos: Saponinas, glicósidos cardiacos, glicósidos cianogénicos y

glucosilonatos.

Alcaloides

A continuación se presenta una breve descripción de cada una de las

clasificaciones antes mencionadas.

Terpenos

Constituyen el grupo más numeroso de metabolitos secundarios considerando que

son más de 40.000 moléculas diferentes. La ruta biosintética de estos compuestos

da lugar tanto a metabolitos primarios como secundarios de gran importancia para

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el crecimiento y supervivencia de las plantas. Entre los metabolitos primarios se

encuentran hormonas (giberelinas, ácido abscísico y citoquininas), carotenoides,

clorofilas y plastoquinonas (fotosíntesis), ubiquinonas (respiración) y esteroles (de

gran importancia en las estructura de membranas). Son compuestos solubles en

agua y derivan de la unión de unidades de isopreno (5 átomos de C).

Los terpenos se clasifican por el número de unidades de isopreno (C5) que

contienen: Los monoterpenos con 10 C; los sesquiterpenos con 15 C, los diterpenos

con 20 C. Los triterpenos que tienen 30 C, los tetraterpenos que tienen 40 C y se

habla de politerpenos cuando contienen más de 8 unidades de isopreno.

Compuestos fenólicos

Las sustancias que sintetizan las plantas con un grupo fenol reciben el nombre de

compuestos fenólicos, polifenoles o fenilpropanoides. son un grupo muy diverso que

comprende desde moléculas sencillas como los ácidos fenólicos hasta polímeros

complejos como los taninos y la lignina. En el grupo también se encuentran

pigmentos flavonoides Muchos de estos productos están implicados en las

interacciones planta-herbívoro.

Existen dos rutas básicas implicadas en la biosíntesis de compuestos fenólicos: la

ruta del ácido siquímico y la ruta del ácido malónico.

La ruta del ácido malónico es una fuente importante de fenoles en hongos y

bacterias, pero es poco empleada en plantas superiores. La ruta del ácido siquímico

es responsable de la biosíntesis de la mayoría de los compuestos fenólicos de

plantas.

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Glicósidos

Su nombre hace referencia al enlace glicosídico que se forma cuando una molécula

de azúcar se condensa con otra que contiene un grupo hidroxilo. Existen tres grupos

de glicósidos de particular interés: saponinas, glicósidos cardiacos y glicósidos

cianogénicos. Una cuarta familia, los glucosinolatos, se incluyen en este grupo

debido a su estructura similar a los glicósidos.

Las saponinas se encuentran como glicósidos esteroideos, glicósidos esteroideos

alcaloides o bien glicósidos triterpenos y contienen una o más moléculas de azúcar

en su estructura.

Los glicósidos cardiacos o cardenólidos son semejantes a las saponinas

esteroideas, tienen propiedades detergentes, pero su estructura contiene una

lactona. Se encuentran de forma natural en forma de glicósidos o de agliconas.

Los glicósidos cianogénicos son compuestos nitrogenados, que no son tóxicos pero

se degradan cuando la planta es aplastada liberando sustancias volátiles tóxicas

como cianuro de hidrógeno (HCN).

Los glucosinolatos, se degradan y desprenden sustancias volátiles responsables

del aroma, el olor y el gusto de condimentos como la mostaza y de vegetales de la

familia Brassicaceae.

Alcaloides

Los alcaloides son una familia de más de 15.000 metabolitos secundarios que tienen

en común tres características: son solubles en agua, contienen al menos un átomo

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de nitrógeno en la molécula, y exhiben actividad biológica. La mayoría son

heterocíclicos aunque algunos son compuestos nitrogenados alifáticos (no cíclicos)

como la mescalina o la colchicina. Se encuentran en el 20% aproximadamente de

las plantas vasculares, la mayoría dicotiledóneas herbáceas.

Cultivo in vitro

El cultivo in vitro es una técnica que comprende la micropropagación, el aislamiento

y el cultivo de embriones, la regeneración, a partir de callos o de suspensiones

celulares, el cultivo de protoplastos, anteras y microsporas. Ésta técnica se ha

utilizado en todo el mundo para la multiplicación de plantas a gran escala y es muy

factible debido a que da como resultado la producción de material de plantación de

gran calidad y libre de enfermedades. La clave del cultivo in vitro consiste en extraer

porciones de tejidos inmaduros (explantes), que siguen conservando su potencial

morfogenético (totipotencia) y cultivarlos en medios nutritivos suplementados con

mezcla de dos tipos de homornas vegetales, que son las auxinas, las cuales inducen

el crecimiento de raíces y las citocininas que induce la caulogénesis.

El fundamento del cultivo in vitro se basa en la totipotencia de las células vegetales,

que consiste en la habilidad de dividirse y producir todas las células diferenciadas

de un organismo.

Uno de los factores para obtener la respuesta morfológica deseada en un cultivo de

tejido in vitro, es la composición del medio de cultivo, el cual está conformado por

macro y micronutrientes esenciales para la supervivencia de la planta, nutrientes

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(hidratos de carbono, vitaminas), agentes reguladores del crecimiento y hormonas

vegetales.

Hierba del sapo

La hierba del sapo pertenece a la familia de las umbelíferas; el género Eryngium

alberga alrededor de 230 especies, su uso en medicina tradicional en México data

desde tiempos prehispánicos. Ésta planta ha sido estudiada debido a la capacidad

de reducir los niveles de colesterol y triglicéridos.

Es una hierba sin tallo aparente, que alcanza aproximadamente los 50 cm de altura,

las hojas son basales dispuestas en forma de roseta, las flores son en forma de

cabezuelas de color azul, violeta o blanco.

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DESCRIPCIÓN DE LAS ACTIVIDADES REALIZADAS

Extracción clorofórmica

Se utilizaron dos ejemplares de rábano negro (Raphanus sativus L. var. niger) se

extrajo la corteza del fruto en cortes semifinos. La corteza extraída se recolectó en

un vaso de precipitados de 500 mL, previamiente lavado y esterilizado. Se pesaron

10 matraces Erlenmeyer de 20 mL en una balanza analítica y se agregaron 2 g de

corteza de R. sativus a cada matraz. A cada muestra se adicionaron 20 mL de

cloroformo, los matraces se cubrieron con un tapón de aluminio y se etiquetaron.

Posteriormente, con un bisturí se realizaron cortes semifinos del fruto de R. sativus

en fragmentos de 0.5 cm y se colectaron en un vaso de precipitados de 50 mL,

posteriormente se pesaron 10 matraces Erlenmeyer de 20 mL y se agregaron 2 g

de las hojuelas del fruto. A las muestras se les añadió 20 mL de cloroformo, se

cubrieron con un tapón de aluminio y se etiquetaron (Figura 7).

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Figura 7. Método de extracción clorofórmica a partir de la corteza y fruto de R. sativus. a) Ejemplar de rábano negro (Raphanus sativus L. var niger); b) Extracción de la corteza de R. sativus; c) Corteza de R. sativus en vaso de precipitados; d): Fruto de R. sativus sin epidermis; e) Hojuelas de fruto de R. sativus depositadas en un vaso de precipitados de 50 mL; f) Matraz con 2 g de corteza de R. sativus; g) Muestras de corteza de R. sativus colocada en un matraz con 20 mL de cloroformo; h) Matraz con 2 g de muestra de fruto de R. sativus; i) Muestras de fruto R. sativus en un matraz con 20 mL de cloroformo.

Extracción etanólica

Se extrajo la corteza de R. sativus de un segundo ejemplar con un bisturí. La

corteza extraída se colectó en un vaso de precipitados de 500 mL, previamente

lavado y esterilizado. Posteriormente se pesó un matraz de recuperación de 50 mL

y se agregaron 2 g de corteza. A cada muestra se adicionaron 50 mL de etanol, con

10 repeticiones.

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Se realizaron cortes semifinos del fruto der R. sativus con un bisturí, los cortes se

colectaron en un vaso de precipitados de 50 mL. Se pesaron 10 matraces de

recuperación de 50 mL y se agregaron 2 g de fruto de R. sativus. Finalmente, a cada

matraz se le adicionaron 50 mL de etanol.

Figura 8. Método de extracción etanólica de la corteza y fruto de R. sativus a)

Corteza de R. sativus en matraz de recuperación con 50 mL de etanol; b) Muestras

de fruto de R. sativus en matraz con 50 mL de etanol

Extracción metanólica

Se utilizaron dos ejemplares de R. sativus para extraer la corteza con un bisturí en

cortes semifinos de 0.5 cm. La corteza extraída se colectó en un vaso de

precipitados de 500 mL, previamente lavado y esterilizado. Se pesaron 10 matraces

Erlenmeyer de 20 mL con una balanza analítica y se agregaron 2 g de corteza de

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Filtración, evaporación y concentración de compuestos

Las 40 muestras de R. sativus, que se obtuvieron mediante la extracción

clorofórmica y la extracción metanólica, se filtraron por gravedad con un embudo

cónico y papel filtro para eliminar los sólidos. La suspensión de cada matraz se

colectó en tubos de ensayo de vidrio con tapa y se etiquetaron.

Las 20 muestras de extracción etanólica se filtraron por gravedad con un embudo

cónico y papel filtro, para eliminar los sólidos del fruto y de la corteza de R. sativus,

la suspensión de cada muestra se colectó en matraces Erlenmeyer y se etiquetaron.

Posteriormente, se tomaron 10 mL de cada repetición de las muestras de fruto y de

corteza de R. sativus con los distintos solventes y se depositaron en matraces

Erlenmeyer de 25 mL. Cada matraz se colocó en una placa calefactora para

evaporar totalmente el solvente.

Finalmente se adicionó 1 mL del solvente correspondiente a las muestras secas de

fruto y de corteza de R. sativus de cada matraz.

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Figura 10. Concentración de extractos de R. sativus. a) Filtración por gravedad de

extracto de R. sativus en matraz Erlen meyer; b) Muestra con 10 mL de extracto de

R. sativus; c) Evaporación de los extractos en placa; d) Muestras en proceso de

ebullición; e) Muestras sin solvente.

Figura 11. Muestras evaporadas de etanol con 1 mL de solvente.

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Determinación de vitamina C en extractos etanólicos de Raphanus sativus.

Para la determinación de vitamina C en R. sativus se utilizó una solución indicadora

preparada en el laboratorio.

Se mezclaron 8 g de almidón de maíz con 5 mL de agua, se adicionaron 250 mL de

agua a la pasta, se hirvió durante 5 minutos en una placa.

Se adicionaron 75 mL de agua en un matraz, 10 gotas de la disolución preparada

con almidón de maíz y 15 gotas de tintura de yodo, lo que provocó un cambio de la

solución a un color azul. (Figura 12).

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Figura 12. Preparación de solución indicadora de presencia de vitamina C en extractos etanólicos. a) Solución de almidón de maíz con 250 mL de agua; b) solución de almidón de maíz en ebullición; c) solución de 75 mL de agua y 10 gotas de solución de almidón; d) Solución indicadora finalizada con 15 gotas de tintura de Yodo.

Determinación de vitamina C

Posteriormente se adicionaron 10 mL de la solución indicadora a un tubo de ensayo,

con 10 repeticiones para el extracto etanólico de corteza de R. sativus y 10

repeticiones para los extractos etanólicos de fruto de R. sativus. Se adicionaron 10

gotas de extracto etanólico de corteza y de fruto de R. sativus a cada uno de los

tubos y se agitó suavemente.

La presencia de vitamina C en los extractos provocó la decoloración de la solución

indicadora. (Figura 13).

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Figura 13. Determinación de vitamina C en R. sativus. a) Solución indicadora en tubos de ensayo; b) adición de 10 gotas de extracto etanólico de R. sativus; c) muestras de extractos etanólicos de fruto de R. sativus con solución indicadora; d) Muestras de extractos etanólicos de corteza de R. sativus con solución indicadora.

PRODUCTOS DEL PROYECTO

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El diseño experimental empleado consistió en la extracción con de los alcaloides y

los isotiocianatos por medio de tres solventes orgánicos (cloroformo, metanol y

etanol), con 20 repeticiones (10 para la extracción del fruto y 10 para la extracción

de la corteza) para cada tipo de solvente.( Cuadro 1).

La extracción de alcaloides e isotiocianatos con cloroformo se presenta en la página

número 25, la extracción etanólica de alcaloides e isotiocianatos se presenta en la

página número 27, la extracción metanólica en la página número 28. La prueba de

presencia de vitamina C en los extractos etanólicos de Raphanus sativus se

presenta en la página 30.

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

Cuadro 1. Diseño experimental de extracción de isotiocianatos y alcaloides a partir de R. sativus

Tipo de extracción Composición

No. De repeticiones

Extracción clorofórmica 2 g de fruto

20 mL de cloroformo

10

2 g de corteza 10

Extracción metanólica

2 g de fruto

20 mL de metanol 10

2 g de corteza 10

Extracción etanólica 2 g de fruto

50 mL de etanol 10

2 g de corteza 10

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Se concluye que la extracción de los isotiocianatos y alcaloides a partir de R. sativus

se logró con éxito con los tres distintos solventes orgánicos. Además de que la

mayor concentración de vitamina C se identificó en la corteza por medio del extracto

etanólico.

Para futuros investigaciones se recomienda llevar a cabo un análisis cuantitativo de

la cantidad de compuestos alcaloidales e isotiocianatos con una mayor

concentración de solventes.

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